La descarga está en progreso. Por favor, espere

La descarga está en progreso. Por favor, espere

Parte III. Cinética enzimática.

Presentaciones similares


Presentación del tema: "Parte III. Cinética enzimática."— Transcripción de la presentación:

1 Parte III. Cinética enzimática

2 CINÉTICA Es el estudio de las velocidades de las reacciones, aporta las bases para el entendimiento de cómo ocurre una reacción.

3 Mecanismo de la reacción
La descripción de una reacción en términos de las etapas implicadas y la velocidad de la reacción se denomina mecanismo de la reacción. ¿Cuántas etapas están implicadas? ¿Cuál es la etapa más lenta y que, por tanto, limitaría la velocidad de la reacción total?

4 La primera clave en cuanto al comportamiento enzimático lo aportaron:
V. Henri (1903) y posteriormente L. Michaelis y Maud L. Menten (1913).

5 Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y En la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre

6 Según esto, podemos afirmar que:
Kcat En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que: v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES]

7 [ET] = [E] + [ES] la concentración total de enzima depende de la cantidad de enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES). [ET] es constante a lo largo de la reacción Como [E] = [ET] - [ES] y v1 = k1 [E] [S] resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

8 MODELO DEL ESTADO ESTACIONARIO

9 Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3) v1 = v2 + v3 k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

10 Despejando [ES], queda que:
, siendo

11 Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:
v = v3 = k3 [ES] =

12

13 Definición Km Es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.

14 Km y afinidad? El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad. KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).

15 Qué se necesita para medir la velocidad de reacción enzimática?
Extracto proteico que muchos casos no proviene de una purificación exhaustiva o del aislamiento de la enzima. La medida se realiza siempre en las “condiciones óptimas” de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.

16 Vmax En condiciones “óptimas” y saturantes de la enzima, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

17 Reacción que cataliza la lactato deshidrogenasa
La reducción del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima.

18 Desarrollo experimental
1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 4 mM NADH Diluciones apropiadas de enzima.

19 La actividad de una enzima tiene unidades de velocidad.
m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min : es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1. b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Vensayo: es el volumen total del ensayo. F: es el factor de dilución para la enzima

20 Tabla de purificación de proteínas

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31 Especificidad vs afinidad
ESPECIFICIDAD. Es la capacidad que tiene una enzima de discriminar entre posibles sustratos. AFINIDAD. Estabilidad del complejo ES. Nos indica la capacidad que tiene la enzima para formar un complejo con un determinado sustrado. Kd del complejo ES o Km

32

33

34

35 Representación de dobles recíprocos

36 Representación de Eadie-Hofstee
pendiente

37

38 Inhibidores Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción: Naturales Artificiales Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la célula

39 Interacción inhibidor-enzima
La interacción de un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza química del inhibidor así como de la reacción química que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de la enzima.

40 Inhibidores competitivos.
Son moléculas que tienen una similitud estructural y química al sustrato de la enzima. El inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El inhibidor bloquea el sitio activo. El inhibidor y el sustrato no se encuentran al mismos tiempo en el sitio activo. El aumento en la concentración de sustrato reduce la inhibición.

41 Inhibidor competitivo
Similaridad estructural

42 Inhibición competitiva

43 Diferentes gráficos nos pueden ayudar a determinar la constante de inhibición (Ki)
.                                                                                                                               

44 Gráficos comparados de la actividad con y sin inhibidor
En la gráfica de dobles recíprocos: No cambio en Vmax Si cambia Km

45 Inhibidor no competitivo.
El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no competitivo puro es aquel en el que sólo se altera la capacidad de unir al sustrato.

46 Inhibidores NO competitivos
La mayoría da una inhibición de tipo mixta, es decir, no sólo se afecta la unión del sustrato sino también la conversión del sustrato a producto. Los inhibidores mixtos alteran tanto la Vmax como la Km de la enzima.

47 INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
MIXTA PURA

48 Inhibidor acompetitivo.
Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir sólo se une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato expone o crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formación de producto. El inhibidor acompetitivo altera la Km de la enzima.

49 http://www-biol. paisley. ac. uk/kinetics/Chapter_3/contents_chap3
Diferentes tipos de efectos de los inhibidores sobre los parámetros cinéticos de las enzimas

50


Descargar ppt "Parte III. Cinética enzimática."

Presentaciones similares


Anuncios Google