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© PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias B I O T E C N O L O G Í A Ingeniería genética.

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1 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias B I O T E C N O L O G Í A Ingeniería genética

2 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias BIOTECNOLOGÍA Visión general: En la práctica: Utilización de los seres vivos para beneficio humano La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo. Producción de alimentos y bebidas Obtención de medicamentos Clonación, mapas genéticos, Organismos transgénicos, terapia génica

3 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias INGENIERÍA GENÉTICA a)Tecnología de ADN recombinante b)Clonación y expresión de genes c)Aplicaciones

4 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias PROCESO…(ADN recombinante) 1.Fragmentar y aislar el ADN 2.Unión a vectores. 3.Introducción en las células. 4.Clonación 5.Búsqueda del clon idóneo. 6.Análisis del ADN clonado: transferencia Southern, 7.Secuenciación. 8.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

5 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias FRAGMENTACIÓN DEL ADN Por endonucleasas de restricción Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

6 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias ACCIÓN DE ENDONUCLEASAS Generan extremos cohesivos. Si se actúa sobre dos ADNs diferentes con la misma endonucleasa, al juntarlos se unirían espontáneamente.

7 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias IMÁGENES DE ACCIÓN ADN ENDONUCLEASAS

8 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias EN DETALLE…

9 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias MAPA DE RESTRICCIÓN Mapa físico de un segmento de ADN que muestra los lugares de corte de endonucleasas específicas y la distancia entre pares de bases. Indica puntos de corte Se reflejan determinadas secuencias de nucleótidos. Permite comparar ADNs y ver su similitud (detección de mutaciones)

10 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias EJERCICIO 1 Un fragmento lineal de ADN de 7Kb se corta por separado con dos endonucleasas de restricción y luego con una mezcla de ambas obteniéndose los fragmentos indicados a continuación : Endonucleasa de restricción Tamaño de los fragmentos (Kb) EcoRI3.0 y 4.0 HaeIII2.0 y 5.0 EcoRI + HaeIII2.0, 1.0 y 4.0

11 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias EJERCICIO 1 - Solución

12 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias APLICACIÓN MAPA RESTRICCIÓN Permite diferencias ADNs de individuos de diferentes especies. POLIMORFISMO DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP) (cada individuo tiene diferente colección de fragmentos para la acción de una misma colección de endonucleasas)

13 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias 2. UNIÓN A VECTORES Los vectores deben ser tratados con las mismas endonucleasas de restricción. Luego se produce la unión del vector con el fragmento de ADN a introducir. Los vectores son estructuras que permiten introducir material genético en el interior de otra célula.

14 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias PLÁSMIDOS Son moléculas de ADN circular e bacterias. Tienen replicación independiente. Además, otros genes Facilidad para la manipulación. Porta marcadores específicos: permiten diferenciación posteror.

15 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias IMAGEN DE UNIÓN PLÁSMIDO

16 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias FAGOS Virus que infectan bacterias (bacteriófagos) Transducción: incorporan material genético del huesped. Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material del antiguo huesped. Ej. Bacteriofágo o fago.

17 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias FAGO LAMBDA Un vector ampliamente usado para crear DNA recombinante. 48,502 pares de bases de longitud. Usualmente un DNA recombinante de lambda tiene 80% DNA del vector y 20% del DNA insertado. CICLO DE UN VIRUS

18 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias CÓSMIDOS Fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y el sitio COS. (similares a plásmidos) Sitio COS: provoca el empaquetamiento del ADN. Conclusión: permite transportar grandes cantidades de ADN.

19 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias OTROS Cromosomas artificiales de levadura: YACs Retrovirus Cromosomas humanos artificiales: HACs

20 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias RESUMEN VECTORES

21 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias 4. CLONACIÓN Sacar copias del ADN que se ha unido al vector. Se utiliza un huesped: –Capacidad de crecimiento rápido. –No ser dañino o patógeno –Ser capaz de aceptar el ADN exógeno y que éste permanezca estable. –El huésped debe tener enzimas para la replicación del vector. Bacterias: E. coli y B. subtillis.

22 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias Escherichia coli como vector Potencialmente patógeno Producción de endotoxinas.

23 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias CLONACIÓN EN EUCARIOTAS EL más utilizado Saccharomyces cerevisiae. –Es capaz de recibir plásmidos. –También YACs (cromosomas artificiales de levadura) Cultivos celulares de mamíferos: –Manejo parecidos a huéspedes bacterianos. –Ventaja: tienen proceso maduración del ARNm y así ya es directamente funcional.

24 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias UTILIZACIÓN DE YACs

25 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias 5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO Hay muchos tipos de bacterias transformadas. ¿Cuál tiene el fragmento de ADN exógeno que nos interesa? Se saca réplica en membrana. Se desnaturaliza ADN con NaOH.

26 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias 5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO Se desnaturaliza el ADN con NaOH. Se añade sonda radioactiva: complementaria al gen que se quiere buscar. Se lava el ADN monohebra (sólo queda el híbrido) Se pone placa fotográfica. Biblioteca genómica

27 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias APLICACIÓN MÉDICA OBTENCIÓN DE LA INSULINA

28 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias 6. IDENTIFICACIÓN DE GENES - Southern Es un mecanismo mediante el cual se pueden identificar genes que se encuentren en fragmentos de restricción. Aplicación: –Diagnóstico de enfermedades –Huella genética Concepto previo: electroforesis

29 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias ELECTROFORESIS EN GEL Gel de Agarosa (polímero de galactosa) Se ponen en pozitos en un extremos los fragmentos de ADN Se somete a un campo eléctrico (grupos fosfato son arrastrados al polo +) Fragmentos más grandes emigran menos. Los pequeños más.

30 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias MÉTODO SOUTHERN 1.Electroforesis en gel (separación de fragmentos por tamaño) 2.Desnaturalización (a ADN de cadena sencilla) 3.Transferencia a filtro de nitrocelulosa (los papeles secantes absorben el tampón y los ADN monohebra se pegan al filtro) 4.Hibridación con sondas marcadas P Eliminación de sondas no unidas. 6.Exposición a la película fotográfica y revelado 7.Identificación de fragmentos V E RV E R 2

31 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias AMPLIFICACIÓN PCR Objetivo: obtener millones de copias en poco tiempo de fragmentos de ADN. Se basa en el enzima:, obtenida de Thermobacillus. Sólo se necesita conocer la secuencia de los extremos para fabricar cebadores. Tras varios ciclos se forman millones de copias.

32 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias AMPLIFICACIÓN POR PCR

33 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias POLIMERASA CHAIN REACTION

34 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias CADENA DE REACCIÓN DE LA POLIMERASA - 1

35 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias PCR 2

36 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias CICLO DE UN VIRUS

37 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias SOUTHERN

38 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias Método southern

39 © PROFESOR JANO – VÍCTOR M. VITORIA – Estrategias de trabajo y aprendizaje Desarrollo de las inteligencias Producción de alimentos y bebidas Obtención de medicamentos


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