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Toxicidad de Efavirenz y Lopinavir/r sobre los adipocitos Pere Domingo Unidad de Enfermedades Infecciosas Hospital de la Santa creu i Sant Pau Universitat.

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1 Toxicidad de Efavirenz y Lopinavir/r sobre los adipocitos Pere Domingo Unidad de Enfermedades Infecciosas Hospital de la Santa creu i Sant Pau Universitat Autònoma de Barcelona

2 Contenido Implicaciones,consecuencias y visibilidad de la lipoatrofia Fármacos y lipoatrofia (EFV vs. LPV/r) Mecanismos patogénicos en la lipoatrofia El papel de la mitocondria EFV, LPV/r y adipocitos in vitro EFV, LPV/r y adipocitos ex vivo

3 33 Implicaciones de la lipoatrofia Calidad de vida Efectos psicológicos – Baja autoestima – Disminución de la autoconfianza – Ansiedad y depresión Efectos sociales – Daño en la calidad de la relaciones sociales – Alienación social – Dificultad para encontrar ropa adecuada Efectos físicos (ej, dolor al sentarse) Disfunción sexual Descenso de la adherencia ODonovan CA et al, 7 th IWADRL Nov 2005, Dublin, #34; James J et al, Dermatol Surg 2002; 28: Santos CP et al, AIDS 2005;19(S4):S14-S21; Reynolds NR et al, AIDS Care Oct 2006; 18(7):663-73

4 Todos los estudios, principalmente hombres Estudios en VIH, Controles sanos voluntarios* Adultos VIH+, Lipoatrofia clinicamente evidente al comienzo* Grasa en las extremidades (kg) *Todos los estudios utilizaron DEXA para medir la grasa. 1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr. 1999;69:1162–1169; 2. Carr A et al. AIDS. 1998;12:F51–F58; 3. Moyle G et al. CROI Abstract 44LB; 4. McComsey GA et al, Clin Infect Dis. 2004;38:263–270; 5. Martin A et al. AIDS. 2004;18:1029–1036; 6. Milinkovic A et al. Antivir Ther. 2007;12:407–415; 7. Carr A et al. Lancet. 2004;363:429–438; 8. Slama L. Antivir Ther. 2007, in press. La lipoatrofia se hace clínicamente evidente después de perder el 40%-50% de la grasa en la extremides MujerHombre

5 55 Mínima ganancia en la grasa en las extremidades 48 semanas después del cambio de los NRTI Importancia del diagnóstico temprano: La lipoatrofia es difícil de revertir Otros estudios dieron resultados similares 1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr. 1999;69:1162–1169; 2. Moyle GJ et al. AIDS. 2006;20:2043–2050; 3. Carr A et al. AIDS. 1998;12:F51–F58. Limb fat (kg) Normal 1 Pacientes lipoatróficos al comienzo 2 Pacientes tras el cambio de análogos 2

6 6 EFV LPV/r Weeks Cambio % de la mediana desde la basal ACTG 5142 Grasa en las extremidades LPV/r + EFV <.001 P Value EFV LPV/r LPV/r + EFV ACTG 5142: Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre la grasa periférica: LPV/r < EFV Haubrich R et al. 14th CROI 2007; Los Angeles. Abstract #38.

7 7 ACTG 5142: La prevalencia de lipoatrofia fue menor con Kaletra que con EFV EFV LPV/r LPV/r + EFV Valores de P a 96s LPV/EFV vs LPV: 0,023 LPV/EFV vs EFV: <0,001 LPV vs EFV: 0,003 Haubrich R et al. AIDS Jun 1;23(9): Evolución de la lipoatrofia (> 20% de pérdida de grasa en las extremidades)

8 8 ACTG La prevalencia de lipoatrofia fue menor con LPV/r que con EFV independientemente de los análogos utilizados 51% n=41 33% n=43 16% n=73 12% n=67 6% n=50 40% n=63 Haubrich R et al. AIDS Jun 1;23(9): Porcentaje de pacientes con lipoatrofia por subgrupos, semana 96

9 9 ACTG La prevalencia de lipoatrofia fue menor con LPV/r que con EFV independientemente de la definición de lipoatrofia elegida % pacientes 32% 28% 40% 17% 20% 10% 13% 4% p=0,0027 p=0,0004 p=0,0016 p=0,0008 Haubrich R et al. AIDS Jun 1;23(9):

10 10 Estudio transversal alemán. Resultados: Características de los pacientes LPV/rEFV Nº de pacientes Edad en años Duración media del tratamiento [años] Adeherencia autoreferedia [%]> 95 El 45% estabán tomando TDF, 28% AZT/3TC y 12% ABC/3TC Alta concordancia entre las opiniones de los pacientes y de los médicos Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111

11 11 Estudio transversal alemán. El porcentaje de pacientes que reportan haber pérdido grasa en las piernas fue menor con Kaletra que con EFV p < 0,05 % pacientes que reportan pérdida de gras en las piernas El 79 % de los pacientes tratados con Kaletra no reportó signos de pérdida de grasa en las piernas frente a sólo 68% entre los tratados con EFV. Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111

12 12 Estudio transversal alemán. Este resultado se repitió en los tratados con AZT/3TC p < 0,05 % pacientes que reportan pérdida de gras en las piernas Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111

13 13 Estudio transversal alemán. Entre los tratados con TDF/3TC o FTC también hubo menos pacientes que notaron pérdida de grasa en las piernas en el grupo de Kaletra que en el de EFV p < 0,05 % pacientes que reportan pérdida de gras en las piernas Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111

14 14 Causas de la lipoatrofia Virus VIH PacienteGenética/Ambiente Lipoatrofia HAART

15 15 Mecanismos fisiopatológicos de la lipodistrofia a nivel celular Disfunción mitocondrial Proliferación mitocondrial y morfología alterada 2 Ciclo celular y diferenciación adipocitaria alterada Descenso del tamaño de los adipocitos 1-3 Apoptosis aumentada 4 Sustitución de los adipocitos por tejido fibrosos 3 Mediadores proinflamatorios Infiltración de macrófagos 2,3 Expresión de IL-6 y TNF - aumentada 3 X 400 Control 1 X 200 Patient Aumento del número de adipocitos pequeños 1 Patient X 400 Incremento del número de macrófagos 3 1.Bastard JP, et al. Lancet 2002: 359: Nolan D, et al. AIDS 2003; 17: Jan V, et al. Antivir Ther 2004; 9: Domingo P, et al. AIDS 1999; 13:

16 16 Investigación para esclarecer el papel de Kaletra en la lipoatrofia Mitocondria Adipocito Individuo Estudio 613 ACTG 5142 Dr. van Lunzen Dr. Esplugues Dr. Domingo T. Adiposo Dr. A. Carr Dr. Domingo

17 17 Estructura mitocondrial AND mitocondrial (mtDNA) – 16 kb, 2-10 copias/mitocondria en la matriz – La replicación está controlada por genes mitocondriales La DNA polymerasa- γ mitocondrial es la enzima requerida para la replicación del mtDNA La inhibición de la mtDNA polymerasa- γ conduce a la depleción del mtDNA – Transcripción – proteínas mitocondriales Polimerasa del RNA (mtRNA) y factores de transcripción La apoptosis es parte del proceso natural celular y se incrementa durante la disfunción mitocondrial En el contexto de la disfunción mitocondrial – Se incrementa la apoptosis celular – Puede aparecer hiperlactatemia Mitocondria. Estructura interna HIV Membrana interna Membrana externa Cristae Matriz Adipocito TEM Chan DC, Cell June 2006; 125;7: McBride HM, Current Biology July 2006;16:R551-R560

18 18 1. Kakuda TN. Clin Ther. 2000;22(6):685–708; 2. Birkus G et al. Antimicrob Agents Chemother. 2002;46:716–723. Toxicida inducida por los análogos: Inhibición de la Toxicida inducida por los análogos: Inhibición de la mtDNA Polymerasa- γ Metodos 2 Células humanas tratadas con NRTIs Southern blot para cuantificar mtDNA Los ensayos enzimáticos con NRTIs demuestran la inhibición de la mtDNA polymerasa- 1,2 : zalcitabina (ddC) > didanosina (ddI) > stavudina > zidovudina (ZDV) > lamivudina = abacavir = tenofovir Resultados El grado de inhibición de la DNA polymerase- inhibition varia con los NRTI Algunos NRTIs inhiben la mtDNA polymerasa-

19 19 Disfunción mitocondrial y apoptosis Reactive oxygen species MPTP Disfunción cadena respiratoria Depleción DNAmt,...

20 20 ATP Stress metabólico Disfunción mitocondrial Hypoxia Privación de glucosa Inhibidores metabólicos NADH NAD + -KDH Krebs cycle ADP/ATP AK translocator ATP NADH H+H+ I II III IV Electron transport chain Cito c CoQ NAD + Glucose Pyruvate LDH NADH NAD + Lactate -oxidation Acetyl CoA PDH CPT-1 Fatty acids NADH NAD + Cellular cytosol Mitochondrion matrix Inner membrane Inner membrane space Outer membrane AMPk AAC Malonyl CoA Adapted from Kakuda TN. Clin Ther 2000: 22: ; Dobrzyn P, et al. PNAS 2004; 101: ; Dagan T. Mitochondrion. 2002;1:397–412; 2. Day L et al. Mitochondrion. 2004;4:95–109; 3. Gerschenson M. Mitochondrion. 2004;4(5-6):763–777; 4. McComsey GA. J Acquir Immune Defic Syndr. 2003;34:45–49. Consecuencias potenciales de la disfunción mitocondrial: Disfunciones celulares: - DNA polymerase-g Desacopladoras Transportadoras3 - Stress Oxidativo Apoptosis 2,3 - Fosforilación 2,3 - Procesamiento proteolítico 3 -Glicosilación 3 Complicaciones agudas: Neuropatia 1-3 Esteatosis hepática 1-3 Miopatía 1-3 Pancreatitis 1-3 Acidosis Láctica 1-3 Complicaciones a largo plazo: Lipodystrophy 1-4

21 21 Inhibición aguda de la respiración mitocondrial por EFV 100 (μM) Time (min) Oxygen concentration ** *** Efects of EFV ( M) on respiration rate Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984 MetOH ATV RTVLPV M M Data not shown ** P< 0.01 *** P< % of control

22 22 Fig.3 Intracellular ATP levels Contro l EFV 10 EFV 25 * ** EFV 50 µM La inhibición de la función mitocondrial resulta en una reducción dosis dependiente del ATP intracelular Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984

23 23 FA ligand activated transcription factors Preadipocyte PPARγ C/EBP α Organelle reconstitution Stem cell mitosis PPARδ C/EBPβ/δ SREBP1/ADD1 Adipoblast mitosis E2F, pRb p130/p107 Mature adipocyte Immature adipocyte Lipogenic gene induction LPL, HSL, aP2, perilipin DGAT, GLUT4 TG storage TNF- α Adipocyte differentiation: a highly regulated process Gregoire FM, Physiological Reviews July 1998; 78(3):

24 24 PPAR- gene expression relative to ACTB housekeeping gene at baseline and at 2 weeks of ZDV/3TC or d4T/3TC twice- daily in adipocytes COX-1 gene expression relative to ACTB housekeeping gene at 6 weeks of ZDV/3TC or d4T/3TC twice-daily in monocytes 20 HIV- volunteers received dual NRTI therapy for 6 weeks (ZDV/3TC or d4T/3TC ) In the absence of mtDNA depletion, thymidine analogue NRTIs down- regulate: – Adipocyte differentiation factors (nuclear transcription factor PPAR- ) – Transcription of mitochondrial chain respiratory subunits (COX-1, Cox-2, and Cyt b) Negative regulatory effects impede adipogenesis and respiratory chain complexes (eg. Complex IV via COX1 inhibition) NRTI effects on peripheral mononuclear blood cells suggest a possible role in other tissues Mallon PW et al. J Infect Dis. 2005;191:1686–1696. Mechanisms of NRTI-Induced Mitochondrial Toxicity P = PPAR- γ : ACTB 1.8 COX1 : ACTB P = 0.01 P = BaselineWeek 6Week 12Follow up* * Median = 66 weeks BaselineWeek 2

25 25 Effect of EFV and LPV/r on differentiating adipocytes Control (No drug) 0.5 μM 2 μM 4 μM Massive cell death - no image available 10 μM 0.5 μM 2 μM 4 μM10 μM EFAVIRENZ KALETRA Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01 Control (No drug) EFAVIRENZ KALETRA 2 μM 4 μM 20 μM 2 μM 4 μM 20 μM Effect of EFV and LPV/r on mature adipocytes

26 26 Effect of EFV and LPV/r on gene expression EFV (μmol/l) LPV/r (μmol/l) ****** ****** * * * # # Control 10 Adipogenesis (PPARγ) Log mtDNA copy number Log mtDNA copy number Control LPV/r (μmol/l) EFV (μmol/l) 10 Mitochondrial DNA *P<0.05, **P<0.01, ***P< vs. control, # EFV vs. LPV/r Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01

27 27 EFV increases pro-inflammatory cytokines and reduces adiponectin c/w LPV/r in human adipose cells EFV: 4 µM - increase in levels of MCP-1 (5.3-fold), IL-5 (4.2-fold), IL-8 (18.7-fold), PAI-1 (5.7-fold) and HGF (5.5-fold) Significant reduction of adiponectin and leptin (17% and 19% of levels vs controls respectively) LPV/r: No induction of MCP-1, IL-8 and PAI-I Minor but significant reduction in release of adiponectin and leptin (71% and 76% of levels vs controls, respectively) HGF and IL-6 were induced to a similar extent in response to LPV/r and to EFV mRNA: Adiponectin mRNA significantly decreased with [EFV] 2 µM and [LPV/r] 4 µM (EFV inhibition of mRNA significantly worse). Leptin mRNA significantly decreased with [EFV] 2 µM and [LPV/r] 10 µM Conclusions: In human adipocytes in culture, EFV causes a higher release of pro-inflammatory cytokines and a more profound impairment in the release of adiponectin compared to LPV/r. Domingo P et al, 5 th IAS 2009, #TUPEB167

28 28 Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales NaiveTRU+EFV P = NS NaiveTRU-KAL P = NS Adiponectina MCP NaiveTRU+EFV P = NS NaiveTRU+KAL

29 29 Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales NaiveTRU+EFV P = NS NaiveTRU+KAL P = NS PPAR PPAR TNF TNF Naive TRU+EFV P = NS 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5NaiveTRU+KAL P = NS

30 30 Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales NaiveTRU+EFV P = 0, NaiveTRU+KAL P = 0,008 Cyt B NaiveTRU+KAL ADNmt NaiveTRU+EFV

31 31 HIV Infection Contributes to Lipodystrophy Through Alteration of Gene Expression in Adipose Tissue Giralt M et al. Antivir Ther. 2006;11:729–740. Compared to HIV-negative controls, ARV-naïve HIV-positive patients had significant Decreases in mRNA of COX-2, COX-4, UCP2, C/EBP-, PPAR- γ, GLUT4, LPL, leptin, and adiponectin Increases in PGC-1, TNF, and -2 microglobulin PPAR- mRNA/18S rRNA (x10 -4 ) COX-2 mRNA/18S rRNA (x10 -2 ) P< P= P< P=0.018 P= TNF- mRNA/18S rRNA (x10 -6 ) P= P= P=0.051 P=0.027 P=0.023 P=0.046 P=0.001 ControlNaïveLDNon-LD ControlNaïveLDNon-LD ControlNaïveLDNon-LD

32 32 EFV LPV/r Weeks Cambio % de la mediana desde la basal ACTG 5142 Grasa en las extremidades LPV/r + EFV <.001 P Value EFV LPV/r LPV/r + EFV ACTG 5142: Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre la grasa periférica: LPV/r < EFV Haubrich R et al. 14th CROI 2007; Los Angeles. Abstract #38.

33 33 La toxicidad grasa es bifásica Tiempo TARc Grasa subcutánea

34 34 Conclusiones Tres factores implicados en la LD – Virus – Huésped – Fármacos La patogenia de la lipodistrofia es multifactorial – Mitocondria – Diferenciación – Inflamación EFV es más tóxico que LPV/r in vitro. A 48 semanas dicha toxicidad no es apreciable ex vivo. El curso de la LD es bifásico

35 35 Agradecimientos Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Mª del Mar Gutierrez Mª Gracia Mateo Mª Antonia Sambeat Angels Fontanet Jessica Muñoz Jessica Martínez Biologia U.B. Francesc Villarroya Marta Giralt Joan C. Domingo Julieta Díaz

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