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F. Mocholí Seminarios ABI, Noviembre 2007 Aspectos a tener en cuenta en el análisis de triazinas y fenoxiácidos en aguas por LC/MS/MS.

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2 F. Mocholí Seminarios ABI, Noviembre 2007 Aspectos a tener en cuenta en el análisis de triazinas y fenoxiácidos en aguas por LC/MS/MS

3 3 Tiempos Pasados Costosa preparación de la muestra para conseguir extractos muy limpios Evitar contaminación cromatográfica Mantener el sistema inerte Maximizar sensibilidad y obtener la máxima selectividad Pobre selectividad/sensibilidad en HPLC (tecnología de columnas, detector UV detector, Derivatizar y detector de Fluorescencia) Difícil confirmación (mala selectividad en HPLC) Se han llevado a cabo diferentes estrategias para conseguir mejoras

4 4 Tiempos pasados Distintas técnicas para distintos compuestos (UV, derivatización para Fluorescencia, etc.) Pobre selectividad (longitud de onda, espectro UV) Baja sensibilidad Limitado número de compuestos Analizar compuestos nuevos, que no se analizaban antes. Duración de los cromatogramas DAD, 2 m g/L standard

5 5 LC/MS Ionspray GC/MS Ionic Analyte Polarity Molecular Weight Non-Ionic GC-LC/MS Polaridad/Peso Molecular

6 6 Evolución de LC/MS Necesidad de confirmación por MS Número de analitos en aumento Gran esfuerzo en interfases (sensibilidad, robustez) Avances en in tecnología de columnas (resolución, tiempo de análisis), sistemas de HPLC (inyección, volumen muerto, presión, etc.) La ionización en LC/MS solo da 1 ion MS/MS Elección entre tecnologías (Trap, Triple Quad, etc.) Número de analitos en aumento Identificación de desconocidos Número de analitos en aumento

7 7 Ionización por Electrospray

8 8 Ion Spray (ESI)

9 9

10 10 Ion Spray (ESI)

11 11 Ion Spray (ESI)

12 Fuentes de ionización para ESI Electrospray hasta 1 l/min Dependiente de la Concentración Ionspray (Electrospray asistido neumáticamente) Flujos de líquido ul/min Mejor sensibilidad que electrospray en este intervalo de flujos Dependiente de la Concentración TurboIonSpray (Ionspray con gas de secado caliente) Flujos de líquido ul/min Mejor sensibilidad que ionspray en este intervalo de flujos Dependiente de la Concentración Fuente Turbo V (TurboIonspray con doble calefactor y dinámica de los gases) Flujos de líquido ul/min Mejor sensibilidad que turboionspray en este intervalo de flujos Comportamiento dependiente de la masa en algunos intervalos de flujos

13 13 Problema:Baja tolerancia o intolerancia a sustancias poco volátiles Solución:Hacer que los iones describan un camino má o menos tortuoso (Balance entre sensibilidad y robustez) Orthogonal Pepperpot CrossflowLCZaQa Off axis Estrategias para mejorar la robustez

14 14 OSA N2N2 N2N2 TurboIonSpray ® Angle Turbo V source ® Estrategias para mejorar la robustez

15 15 Pares iónicos Evite reactivos que puedan formar pares iónicos fuertes con los iones deseados y puedan neutralizar los iones en disolución. (Se reduce la evaporación de los iones) Efectos competitivos durante la evaporación de los iones Alta concentración de iones de carga similar en la matriz, tampones, etc. compiten en el proceso de evaporación iónica en las microgotas. Supresión Iónica Reducción señal Analito ESI: Mecanismo supresión iónica

16 16 Menos señal a mayor concentración del tampón Supresión señal iónica

17 17 Q1Q2Q3 SIS CID FULL SCAN MS/MS Fuente Ioniz.

18 18 ¿Qué Dwell time debo utilizar? 1 transición MRM (1 compuesto) Como media, se requieren 15 puntos (o al menos 10) para integrar con precisión un pico cromatográfico 30 segundos X X X X X X X X X X X X X X X (Anchura del pico)/(número de puntos)= 30/15 = 2 segundos Se necesita 1 punto cada 2 segundos (2000 ms)

19 19 ¿Qué Dwell time debo utilizar? 2 transiciones MRM (1 compuesto Cuant y Cual) Si dwell time permanece constante; el tiempo para cada compuesto es 2000 ms: 2000 ms ms compuestos: 4000 ms 30 segundos / 4000 ms = 7.5 puntos sólo! 30 segundos XXXXXXXXX X X X X X X XX X X X X X X X XXXXXXXXX

20 20 ¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente? Dwell time constante => El número de puntos para definir el pico cae rápidamente TimeMRM Puntos Número de puntos por pico constante => Dwell time debe disnimuir! Dwell time (ms)MRM Puntos3DTrapQqQ SíSí SíSí SíSí Sí/NoSí NoSí NoSí Anchura de pico 30 s En una columna de 2mm id, 3 m la anchura de pico es normalmente 10 s, así que se debe dividir todo por 3

21 21 Anchura de pico 10 s Para 10 puntos por pico cromatográfico => Dwell time debe disminuir! Dwell time (ms)MRMData points3DTrapQqQ SíSí Sí Sí SíSí Sí/NoSï NoSí NoSí NoSí A medida que disminuye el d.i. o el tamaño de partícula de la columna, la anchura de pico también disminuye, pero para mantener el número de puntos, debe disminuir el Dwell time ¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente?

22 22 Condiciones generales HPLC: 1200 Rapid Resolution Agilent Columna: Phenomenex Gemini 50mm, 2mm, 3 m MS: 3200 QTrap Applied Biosystems Dwell Time: 20ms (interscan delay: 5ms) para 32 transiciones Tiempo total scan s (se podrían hacer 120 transiciones) Patrones preparados en H2O, muestras, agua directa. Calibración de 0.01 a 10 ppb (0.01, 0.05, 0.10, 0.50, 1.00, 2.50, 5.00, g/L)

23 23 Cromatograma general

24 24 Cromatogramas Ametrina, Calibración y Muestra Muestra Concentraciones en g/l

25 25 Cromatogramas Atrazina, Calibración y Muestra Muestra Concentraciones en g/l

26 26 Muestra Concentraciones en g/l Cromatogramas Prometrin, Calibración y Muestra

27 27 Muestra Concentraciones en g/l Cromatogramas Propazina, Calibración y Muestra

28 28 Muestra Concentraciones en g/l Cromatogramas Simazina, Calibración y Muestra

29 29 Muestra Concentraciones en g/l Cromatogramas Terbutilazina, Calibración y Muestra

30 30 Muestra Concentraciones en g/l Cromatogramas Terbutrina, Calibración y Muestra

31 31 Cromatogramas 2,4-D Concentraciones en g/l

32 32 Cromatogramas MCPA Concentraciones en g/l

33 33 Cromatogramas Mecoprop Concentraciones en g/l

34 34 Curvas de calibración AmetrinaAtrazina PropazinaSimazina

35 35 Curvas de calibración TerbutrinTerbutilazina Prometrin

36 36 Curvas de calibración MCPA 2,4-D Mecoprop

37 37 Trap 3D Sensibilidad Full Scan MS 3 (o más) QqQ Sensibilidad MRM Pérdida de Neutros Barrido de Precursores Q TRAP Sensibilidad Full Scan MS 3 Sensibilidad MRM Pérdida de Neutros Barrido de Precursores Tecnologías MS

38 38 Adquisición Dependiente de la Información (IDA) Barrido en Multiple Reaction Monitoring de cientos de compuestos (solamente 1 transición por analito...) Criterio IDA (umbral...) Adquisición automática de espectros en modo Enhanced Product Ion Scans en la trampa Sustracción de Fondo Dinámica y Exclusión Dinámica Búsqueda en bibliotecas de espectros Umbral de señal Exclusión Dinámica Barrido de MRM Scans dependientes Búsqueda de desconocidos

39 39 IDA Explorer

40 40 IDA Explorer

41 41 Espectro MS/MS

42 42 Búsqueda en biblioteca

43 43 Conclusiones A través de los últimos años, se han desarrollado nuevas tecnologías en LC/MS (Interfases ESI, columnas, Triple Quadrupolo, MS/MS, sistemas más rápidos, Híbridos, etc.) permitiendo: Una disminución increíble en los límites de detección Aumento en el número de compuestos en un único análisis Gran Selectividad Preparación de la muestra más sencilla Inequívoca confirmación espectral, full scan MS/MS o Robustez del método que hace más fácil el trabajo en rutina de un laboratorio de plaguicidas. Y la historia continua...

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