EFECTO MODULADOR DE LAS PURINAS ENDÓGENAS EN TERMINALES NERVIOSAS MOTORAS DESPOLARIZADAS POR ALTO POTASIO Alejandro Cinalli, Juan Guarracino, Adriana Losavio.

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1 EFECTO MODULADOR DE LAS PURINAS ENDÓGENAS EN TERMINALES NERVIOSAS MOTORAS DESPOLARIZADAS POR ALTO POTASIO Alejandro Cinalli, Juan Guarracino, Adriana Losavio Laboratorio de Neurofisiología, Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires-CONICET, Buenos Aires, Argentina. E-mail: idimneurofisio@gmail.com Efecto de las purinas endógenas sobre los receptores P2Y y de adenosina A 1, A 2A y A 3 en terminales nerviosas despolarizadas por K +. Para evaluar la participación de las purinas endógenas en altas concentraciones de K + (10, 15 y 20 mM), estudiamos la frecuencia de los potenciales de placa miniatura (fMEPPs) en presencia de los antagonistas selectivos para cada uno de los receptores purinérgicos: 5 µM reactivo azul (receptor P2Y), 0.1 µM DPCPX (receptor A 1 ), 5 µM MRS-1191 (receptor A 3 ) y 50 nM SCH-58261 (receptor A 2A ). Encontramos que en 10 mM K + el reactivo azul provocó un incremento de la fMEPPs del 44.4 ± 10.7 % (n= 6, p<0.05) con respecto a los valores obtenidos en 10 mM K + sin el antagonista, mientras que DPCPX, MRS-1191 y SCH-58261 no modificaron significativamente la neurosecreción. Por otro lado, en 15 y 20 mM K +, los antagonistas de los receptores P2Y, A 1 y A 3 provocaron un incremento significativo (p<0.05) de la liberación asincrónica de ACh: reactivo azul 67.8 ± 11.6 % (n= 5) y 57.5 ± 6.5 % (n= 4); DPCPX 60.4 ± 12.1 % (n= 4) y 56.1 ± 11.8 % (n= 5); MRS-1191 26.2 ± 4.0 % (n= 5) y 30.8 ± 8.5 % (n= 4). La incubación con SCH-58261 no mostró una disminución significativa con respecto a los valores obtenidos sin el antagonista en 15 mM K +, mientras que en 20 mM K +, SCH-58261 indujo una menor secreción de ACh (35.1 ± 6.5%, n= 4, p<0.05). INTRODUCCIÓN En trabajos anteriores hemos demostrado que, en sinapsis neuromuscular de mamífero (SNM), el ATP/ADP y su metabolito adenosina modulan la liberación de ACh al activar receptores presinápticos de ATP P2Y (De Lorenzo et al, 2006) y de adenosina A 1 y A 2A (De Lorenzo et al 2004, Palma et al 2011). Por otro lado, encontramos que la SNM cuenta con receptores A 3 que pueden ser activados por adenosina o por su metabolito inosina (Cinalli et al 2013). Asimismo demostramos que cuando las terminales nerviosas son despolarizadas por alto K +, los agonistas de los receptores P2Y, A 1 y A 3 fallan en producir su efecto inhibitorio sobre la neurosecreción, mientras que la activación de los receptores A 2A permite la acción facilitadora sobre la liberación asincrónica de ACh. Una posible explicación para este comportamiento es que la despolarización sostenida de la membrana presináptica inducida por alto K +, provoque una mayor liberación de ACh y ATP, y por ende, una mayor generación de nucleósidos endogénos (adenosina e inosina) capaces de ocupar los receptores P2Y, A 1 y A 3, no permitiendo la acción de los agonistas exógenos. Nuestro objetivo fue evaluar esta hipótesis y analizar en qué grado el catabolismo del ATP y los transportadores de nucleósidos que se encuentran en las membranas de las células, contribuyen a la concentración de purinas endógenas en el espacio sináptico durante la liberación asincrónica de ACh. MATERIALES Y MÉTODOS Los experimentos fueron realizados en preparaciones frénico- diafragma de ratones CF1 (peso corporal 30-40 g). Los ratones fueron anestesiados con tiopental sódico (50 mg/kg) y luego el hemidiafragma izquierdo fue extraído y transferido a una cámara de registro conteniendo una solución Ringer Krebs (solución control, mM): NaCl 135, KCl 5, CaCl 2 2, MgCl 2 1, glucosa 11, HEPES 5, pH 7.3-7.4, burbujeada con O 2. En los experimentos donde la concentración de KCl fue elevada a 10, 15 o 20 mM, una igual cantidad de NaCl fue removida de la solución para mantener la isotonicidad. El registro de los potenciales sinápticos fue realizado mediante técnicas convencionales de microelectrodos (ClK 3M, resistencia de punta 8-15  ). Todos los experimentos fueron llevados a cabo a temperatura ambiente (20-23° C). Contribución del catabolismo del ATP y de los transportadores equilibrativos de nucleósidos a la concentración de purinas endógenas en la hendidura sináptica en la despolarización inducida por alto K + Para investigar en qué grado contribuye el catabolismo extracelular de ATP como fuente de adenosina endógena en terminales nerviosas despolarizadas por K +, estudiamos la fMEPPs en presencia de 100  M  -MeADP, inhibidor de 5´ecto- nucleotidasa (última enzima en el pasaje de ATP a adenosina) en 10, 15 y 20 mM K +. En 10 mM K +,  -MeADP no modificó significativamente la liberación asincrónica de ACh, sugiriendo que la concentración de adenosina presente en el espacio sináptico no contribuye a la modulación de la liberación del neurotransmisor. Por otro lado, en K + 15 y 20 mM,  -MeADP provocó un incremento de fMEPPs del 101.9 ± 18.0 % (n= 3, p<0.05) y 47.0 ± 12.3 % (n= 3,. p<0.05), respectivamente. Cuando analizamos el papel del transportador equilibrativo de nucleósidos en distintos grados de despolarización de la membrana presináptica, encontramos que en 10 mM K +, 30  M NBTI, inhibidor del transportador, redujo la fMEPPs un 33.2  2.2 % (n= 5, p<0.05) con respecto a los valores obtenidos sin el inhibidor en esa concentración de K +. En 15 y 20 mM K + el comportamiento fue diferente; el agregado de NBTI a las soluciones con alto K + no modificó la secreción de ACh. CONCLUSIONES Cuando las terminales nerviosas motoras son despolarizadas por alto K +, el ATP/ADP, adenosina (y posiblemente inosina) generados endógenamente son capaces de modular la secreción del neurotransmisor al activar a sus receptores específicos. En 10 mM K +, la mayoría del ATP liberado y/o el ADP formado se unen a receptores P2Y ejerciendo una acción moduladora inhibitoria sobre la liberación de ACh. Por otro lado, la concentración de adenosina en el espacio sináptico no es suficiente como para activar a todos los receptores A 1, A 2A y A 3, posiblemente porque el nucleósido formado es captado por los transportadores equilibrativos y llevada al interior de las células. En 15 y 20 mM K +, la cantidad de ATP liberada es tal, que el nucleótido no solo ocupa todos sus receptores, sino que la cantidad de adenosina formada a partir de él, es lo suficientemente grande como para ocupar todos los receptores inhibitorios A 1 y A 3, hecho que fue demostrado al obtener mayor liberación de ACh cuando las preparaciones fueron expuestas a los antagonistas específicos de dichos receptores o directamente cuando la producción de adenosina fue inhibida con el bloqueante enzimático. Es probable que en esta situación experimental, los transportadores equilibrativos estén saturados no pudiendo tomar toda la adenosina del espacio sináptico. Por otro lado, los receptores A 2A excitatorios requieren mayor concentración de adenosina endógena para ser activados, dado que solo en 20 mM K +, el antagonista de los receptores indujo una disminución significativa de la neurosecreción. Estos datos son coherentes con los menores valores de  -MeADP en 20 mM K + si lo comparamos con los obtenidos en 15 mM K +. REFERENCIAS De Lorenzo S, Veggetti M, Muchnik S, Losavio A. Presynaptic inhibition of spontaneous acetylcholine release induced by adenosine at the mouse neuromuscular junction Br J Pharmacol. 142:113-124, 2004. De Lorenzo S, Veggetti M, Muchnik S, Losavio A. Presynaptic inhibition of spontaneous acetylcholine release mediated by P2Y receptors at the mouse neuromuscular junction. Neuroscience 142: 71-85, 2006. Palma AG, Muchnik S, Losavio AS. Excitatory effect of the A 2A adenosine receptor agonist CGS-21680 on spontaneous and K + -evoked ACh release at the mouse neuromuscular junction. Neuroscience 172: 164-176, 2011. Cinalli AR, Guarracino JF, Fernandez V, Roquel LI, Losavio AS. Inosine induces presynaptic inhibition of acetylcholine release by activation of A 3 adenosine receptors at the mouse neuromuscular junction. Br J Pharmacol. 169:1810-1823, 2013. RESULTADOS