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Universidad de Talca Facultad de Ciencias de la Salud Depto.de Bioquímica Clínica e Inmunohematología Iván Palomo LMC.

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1 Universidad de Talca Facultad de Ciencias de la Salud Depto.de Bioquímica Clínica e Inmunohematología Iván Palomo LMC

2 SMP Leucemia Mieloide Crónica (LMC) Mielofibrosis con metaplasia mieloide Policitemia Vera Trombocitemia esencial

3 Enf. Hematológicas malignas Incidencia Leucemia Incidencia (/ ) Todas6–10 LMC1–2 LLC2–3 LMA2–3 LLA1–2

4 EPIDEMIOLOGíA 15-20% de las leucemias (adultos) 3-5% " " (niños) años (promedio 40) 10 años más jóvenes que LLC LMC

5 CARACTERÍSTICAS GENERALES Desorden clonal de una célula troncal Crom. Philadelphia (Ph) se encuentra en granulocitos, megacariocitos, monocitos y cél. eritroides. Gran aumento del pool granulocítico Enfermedad bifásica Fase crónica Fase acelerada Fase aguda (Crisis blástica) LMC

6 ETIOLOGÍA 5% causa conocida Radiaciones Agentes químicos Benzol y derivados Solventes Insecticidas LMC

7 Enf. con alteración molecular única LMC – Enf. proliferativa de stem cells hematopoyéticas – Curso clínico característico Cromosoma de Philadelphia (Ph) Alteración cromosómica única Tirosina kinasa Bcr-Abl – Alteración molecular única – Causa transformación de una Stem cells hematopoyética en clon maligno LMC

8 Crom. Philadelphia (Ph) y gen bcr-abl LMC bcr-abl abl Proteína de fusión Actividad Tirosina Kinasa 22 bcr Ph (or 22q-) 9 9 q+ 1 p210Bcr-Abl p185Bcr-Abl 2-11 Chromosome 9 c-bcr Chromosome 22 c-abl 2-11 Exons Introns CML Breakpoints ALL Breakpoints Translocación recíproca t(9;22) (q34;q11) bcr-abl gene structure

9 Proteínas normales Bcr y Abl y sus contrapartes post-translocación

10 Actividad tirosina kinasa de la proteína Abl n n Tirosinas kinasas -Fosforilan tirosina -Actividad controlada en dominio N-terminal. n n En región C-terminal dominio une a DNA y a los filamentos de actina (regular ciclo celular)

11 Funciones de la proteína Bcr n n Serina-treonina kinasa. n n Tiene homología a proteínas G. n n Puede participar en reparación del DNA.

12 bcr-abl: Transducción de señales Bcr-Abl Cytoskeletal proteins P MYC ? Nucleus P RAS-GAP RAS-GTP SAPK P CBL CRK PI3K P BAD P BCLX L Mitochondria BCLX L BAD RAS-GDP AKT ERK P STAT1+5 P GRB-2 SOS SHC DOK CRKL P MEK1/2 P RAF-1 TYROSINE KINASE ACTIVITY

13 Proliferación Apoposis Adhesión (alteración)

14 LMC 95 LLA Adulto 15–30 Niños 5 LMA 2 Cromosoma Ph Prevalencia en Leucemias

15 Curso clínico: Fases de la LMC (pre-Imatinib) Chronic phase Median duration 5–6 years Accelerated phase Median duration 6–9 months Blast crisis Median survival 3–6 months Advanced phases

16 Fase Crónica CLÍNICA Síntomas Inespecíficos y graduales: Astenia, fatiga, cefalea, pérdida de peso, anorexia Signos Esplenomegalia (80%) Hepatomegalia (20%) Normal LMC

17 Laboratorio Hemograma Estudio citogenético Cariograma Fish RT-PRC bcr-abl FAN Citometría de flujo LMC

18 Laboratorio: Parámetros típicos (según fase) ParameterChronicAcceleratedBlast Crisis WBC count 20 x 10 9 /L WBC count 20 x 10 9 /L Blasts1%–15% 15% 20% Basophils 20% Basophils 20% Platelets or normal or Platelets or normal or Bone marrowMyeloid hyperplasia CytogeneticsPh+ Bcr-Abl+

19 Laboratorio: Fase crónica (cont) Leucocitosis Fórmula leucocitaria alterada Basofilia Eosinofilia Anemia NN Trombocitosis

20 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Reacción leucemoide Sepsis, inflamación, Ca, hemólisis Granulación tóxica, Cuerpos de Döhle FAN aumentadas Ph (-) Mielofibrosis con metaplasia mieloide Poiquilocitosis (GR en lágrima) FAN aumentadas Fibrosis medular Ph (-) LMC

21 Estudio citogenético Cariograma Menos sensible que RT-PCR abl-bcr LMC 9 22

22 Métodos moleculares para detectar bcr-abl cromosoma Ph FISH Fluorescence in situ hybridisation RT-PCR Reverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction

23 InterphaseMetaphase Labeled DNA probe (fluorescent) Nuclear DNA bcr-abl gene Separate DNA strands and add labeled probe Labeled bcr-abl gene Fluorescence in situ hybridisation (FISH)

24 FISH en MO y sangre periférica Alta correlación resultados Peripheral Blood Marrow % Ph % Ph+

25 AMPLIFICACIÓN DE GEN abl/bcr RT-PCR (Reverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction) Más sensible que Cariograma (detecta 1 cél. malig. en >10 6 cél. N) Detección cél. Ph+ ( Diagnóstico y post-trasplante MO) MÉTODO Obtención Cél. Mononucleares de MO ( grad. de densidad) Obtención de RNA Transcripción reversa (obtención cDNA) Transcriptasa reversa, Primers Amplificación DNA polimerasa, Primers, Oligonucleótidos, Termociclador Visualización del producto amplificado Electroforesis Gel agarosa, Bromuro de Ethidio, UV Etapas del RT-PCR Plasma Linfocitos FICOLL; d PMN GR, LMC

26 PM Cont – Ph+ N DNA RT-PCR bcr-abl LMC

27 CRISIS BLÁSTICA Periferia Anemia Trombocitopenia Leucocitosis (>20% Blastos) Leucopenia, Trombocitosis Marcada displasia Médula Ósea Infiltración (mieloblastos) Disminución series normales LMC

28 Opciones terapéuticas n Trasplante alogénico de Progenitores hematopoyéticos. n Tratamientos basados en IFN-α n Quimioterapia: Hidroxiurea, Busulfan n Imatinib, Gleevec (STI571) LMC Transfusión GR (Anemia grave) Transfusión plaquetas (Trombopenia marcada) Antibióticos (Infecciones)

29 Imatinib, Gleevec (STI-571)

30 Tirosina Kinasa 210 kDa Tirosina Kinasa 210 kDa (STI-571) LMC EGF-R Ser474 Imatinib: Mecanismo de acción (Inhibidor de tirosina kinasa)

31 Imatinib: Mecanismo de acción (cont)

32

33 Trasplante de progenitores hematopoyéticos : Alta morbilidad y mortalidad Survival by Disease Stage, June 2001, based on transplants 1987 – Feb P=.0001 LMC

34 IFN- n n IFN- tiene efectos biológicos múltiples: – – Inhibe proliferación celular – – Regula expresón de otras citoquinas – – Modula el Sistema immune n n Respuesta citogenética: puede ocurrir a 12 a 18 meses n n Mejor sobrevida en casos Fase Crónica temprana n n IFN- combinada con cytarabina (Ara-C): mejor respuesta LMC

35 IFN- Buen resultado en fase crónica temprana CHR = complete haematological response; MCR = major cytogenetic response. PhasePatients (n) CHR (%) MCR (%) Chronic <12 mo >12 to <36 mo72628 >36 mo42498 Accelerated61527 Blast Crisis5200

36 Quimoterapia es solo paliativa n n Fármacos citotóxicos orales – – Hydroxyurea – – Busulfan n n Respuesta Hematológica: 90% n n Respuesta citogenéticas: 1%–5% n n No modifica progresión de enfermedad LMC

37 Bcr-Abl: Target terapéutico n n Bcr-Abl: 95% pacientes n n Bcr-Abl: Asociada a causa n n Tirosina kinasa Bcr-Abl: Requerida para función celular de LMC. LMC

38 Imatinib: Inhibe selectivamente kinasas Kinases Inhibited Kinases Not Inhibited v-Abl0.1–0.3Flt-3>10 p210Bcr-Abl0.25c-Fms, v-Fms>10 p185Bcr-Abl0.25EGF receptor>100 TEL-Abl0.35c-erbB2>100 PDGF-R0.1Insulin receptor>100 TEL-PDGF-R0.15 IGF-1 receptor>100 c-Kit0.1 v-Src>10 JAK-2>100

39 Imatinib inhibe crecimiento de células Bcr-Abl positivas *Bcr-Abl–negative cell lines. Bcr-Abl–positive cell lines. Imatinib Concentration ( M ) U937* KG1* SU DHL1* KCL22 K562 KU812

40 Imatinib: Resistencia ocurre principalmente en fase avanzada n n Estados avanzados de Ca s: multiples cambios genéticos n n En fase acelerada: A menudo recaen con resistencia a quimioterapia. n n En crisis blástica: Algunos rsponden pero recaen F. crónicaF. blásticaRecaida Ph+ Ph+ blastsPh-negative Ph+ imatinib- resistant blasts Haematopoietic differentiation Bone marrow to peripheral blood LMC

41 Imatinib: Induce mayor respuesta citogenética *P<.001.

42 Con Imatinib: Respuesta hematológica completa más rápida 94% 55% Imatinib IFN- + Ara-C Months Since Randomisation % Responding

43 Con Imatinib: Cambios citogenéticos más rápidos Imatinib IFN- + Ara-C Months Since Randomisation % Responding 83% 20%


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