Análisis de proteínas Alberto Vivoni Alonso.

Presentación del tema: "Análisis de proteínas Alberto Vivoni Alonso."— Transcripción de la presentación:

1 Análisis de proteínas Alberto Vivoni Alonso

2 Espectrometría de masa

3 Espectro de masa de péptidos
¿Cuántos fragmentos se formarían de este tripéptido? ¿Cuáles serían y cuáles serían sus masas?

4 Fragmentación de terminales

5 Fragmentación del enlace peptídico
Determine la masa de los fragmentos b1,2,3 y Y1,2,3 para Ala-Ala-Ala.

6 Separacion por peso/tamaño
Diálisis Filtración en gel

7 Pregunta ¿En qué orden emergerían las siguientes proteínas en una columna de filtración-gel cuya matriz de gel tiene poros de ~200,000: mioglobulina (Mr = 16,000), catalasa (Mr = 500,000), citocroma c (Mr = 12,000), quimotripsinógeno (Mr = 26,000) y hemoglobina (Mr=66,000).

8 Ultracentrífugación

9 Ultracentrifugación analítica
Ecuación de Svedberg MM = RTs/D(1-m0) s: coeficiente de Svedberg (s) R: constante universal de gases (J/Kmol, J: kgm2/s2) T: temperatura (K) D: difusión (m2/s) m0: fracción de masa de solvente desplazada

10 Pregunta Calcule la masa de una proteína con los siguientes datos experimentales: s = 4.2 x s D = 1.2 x m2/s mo = 0.719

11 Solubilidad Control de precipitación:
Controlando el pH: las proteínas son menos solubles cuando el pH del medio es igual a su pI Aumentando la polaridad del medio Aumentando la no-polaridad del medio

12 Electrophoresis* *pH dependent

13 Pregunta En qué dirección se moverían las siguientes moléculas en un campo eléctrico a los pH indicado? Albúmina (pI= 4.9) a pH 8.0 Ureasa (pI=5.0) a pH 3.0 y 9.0 Ribonucleasa (pI=9.5) a ph 4.5, 9.5 y 11.0 Pepsina ((pI=1.0) a pH 3.0, 7.0 y 9.5 Hemoglobina A tiene un pI = 6.9. Una variante, hemoglobina M, tiene un residuo de glutamato en la posición 67 en vez de valina. Qué efecto tiene esta sustitución en el comportamiento electroforético a pH 7.5.

14 Cromatografía Papel Capa fina Intercambio iónico
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

15 Intercambio iónico Intercambio anónico: intercambian aniones
Intercambio catiónico: intercambian cationes

16 Pregunta Una solución de albumina de huevo (pI = 4.6), b-lactoglobulina (pI = 5.2) y quimotripsinógeno (pI = 9.5) se introducen a una columna de cromatografía de intercambio iónico compuesta de un grupo amonio con carga positiva a un pH de 5.4. La columna luego se eluyó con un amortiguador de 5.4 con un aumento en la concentración salina. ¿En qué orden saldrían estas proteínas de la columna y porqué?

17 Pregunta Ovalbúmina (pI=4.6), ureasa (pI=5.0) y mioglobina (pI=7.0) se agregan a una columna de intercambio iónico con una resina con carga positiva a un pH de 6.5. La columna luego se eluye con un amortiguador de 6.5 con un aumento en concentración de NaCl. En qué orden salen las proteínas de la columna?

18 Caracterización Peso molecular: Estructura: Espectrometría de masa
Ultracentrigufugación analítica Estructura: Rayos X Resonancia magnética nuclear (“NMR”) Dichroismo circular

19 Secuenciación de polipéptidos
Tratamiento Rompimiento del enlace peptídico en el lado del carbonilo Degradación Edman del residuo en el terminal N Tripsina de lisina y arginina Quimotripsina de residuos con cadenas laterales aromátcas o alifáticas voluminosas: fenilalanina, tirosina, triptofán, leucina Bromuro de cianógeno (CNBr) de metionina Staphylococus aureus V8 proteasa de residuos con cadenas laterales con carga negativa

20 Preguntas Prediga los fragmentos que se generan cuando el siguiente péptido se trata con a) tres ciclos de la degradación Edman, b) CNBr, c) tripsina: Ser – Met – Gly – Thr – Lys – Ala – Glu Prediga los fragmentos que se generan cuando el siguiente péptido se trata con a) tripsina, b) quimotripsina, c) S. aureus V8 proteasa: Gly – Ala – Trp – Arg – Asp – Ala – Lys – Glu – Phe – Gly – Gln

21 Preguntas Un polipéptido fue tratado con tripsina y generó fragmentos con las siguientes secuencias: Gly – Gly – Ile – Arg Ser – Phe – Leu – Gly Trp – Ala – Ala – Pro – Lys Ala – Glu – Glu – Gly – Leu – Arg El mismo polipéptido fue tratado con quimotripsina y generó los siguientes fragmentos: Leu – Gly Ala – Glu – Glu – Gly – Leu – Arg – Trp Ala – Ala – Pro – Lys – Gly – Gly – Ile – Arg – Ser – Phe Cuál es la secuencia del péptido.

22 Preguntas Análisis de un octapéptido con glicina en el terminal C da los siguientes fragmentos de secuencias desconocidas: a) CNBr: (Ala, Gly, Lys, Thr) y (Gly, Met, Ser, Tyr) b) Tripsina: (Ala, Gly) y (Gly, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr) c) Quimotripsina: (Gly, Tyr) y (Ala, Gly, Lys, Met, Ser, Thr)

23 Preguntas Determine la secuencia de aminoácidos del decapéptido FP de acuerdo con los siguientes tratamientos: Un ciclo de Edman produce 2 moles de aspartato por mol de FP. 2-mercaptoetanol (rompe puentes disulfuro) seguido de tripsina, produce 3 péptidos: (Ala, Cys, Phe), (Arg, Asp) y (Asp, Cys, Gly, Met, Phe) Carboxypeptidasa produce 2 moles de Phe por 1 de FP. El pentapéptido producido en (b) tratado con CNBr produce ( Met, Asp) y Cys, Gly, Phe). El tripéptido de (d) produce Gly en el primer ciclo de Edman. Cuál es la secuencia?