PLASMIDOS Los plásmidos (también llamados plasmidios) son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes.

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1 PLASMIDOS Los plásmidos (también llamados plasmidios) son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacteria, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Las moléculas de ADN plásmidico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas. Hay algunos plásmidos integrativos, vale decir tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Digamos que rompe el cromosoma y se sitúa en medio, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.

2 Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son circulares, pero también se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayoría de eucariotes

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6 TIPOS DE PLÁSMIDOS Según su control de replicación vegetativa:
Plásmidos de control estricto del número de copias: tienen bajo número de copias por cromosoma en la misma célula. Suelen ser plásmidos de tamaños medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene a 1-2 copias por cromosoma. Plásmidos de control relajado: alto nº de copias por cromosoma (más de 10). Suelen ser plásmidos pequeños (menos de 10 kb). Algunos de ellos tienen un sistema de replicación especial, y son amplificables cuando a las bacterias que los poseen se les añade cloramfenicol: este antibiótico detiene la síntesis de proteínas, lo que afecta a la replicación del cromosoma, ya que para que se inicie cada ciclo de replicación cromosómica se necesita un nuevo "pool" de determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la replicación del plásmido, que de este manera se "amplifica" y aumenta aún más su proporción respecto del cromosoma.

7 El ADN plásmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, las cuales (para un tamaño dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante electroforesis. Las conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad electroforética (velocidad para un voltaje dado), del más lento al más rápido: Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario. Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron cortados o porque el ADN era linear in vivo. Usted puede modelar este como un cordón que no se ha conectado así mismo. circular relajado: ADN que interactúa completamente con ambos filamentos sin cortar, pero que ha sido enzimáticamente “relajado”. Usted puede modelar este dejando un cordón relajado y luego conectándolo a sí mismo. superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o superenrollado (ver más abajo), pero que tiene regiones sin unir que lo hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva alcalinidad durante la preparación del plásmido. ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar, y con forma de remolino, resultando en una forma compacta. La tasa de migración de pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso de altos voltajes, grandes fragmentos migran continuamente a diferentes tasas. Por lo tanto, la resolución del gel decrece con el incremento del voltaje. A un bajo voltaje determinado, la migración de un pequeño fragmento lineal de ADN esta en función de su longitud. Fragmentos lineales largos (de 20kb) migran a cierta tasa sin importar la longitud. Esto es debido a que las moléculas “reptan” desde el centro de la molécula siguiendo el sentido de la matriz de gel. La digestión restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos purificados de plásmidos. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas.

8 Una forma de agrupar plásmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los plásmidos conjugativos contienen “tra-genes”, los cuales ejecutan complejos procesos de conjugación, como la transferencia sexual de plásmidos a otra bacteria. Los plásmidos no-conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugación, de allí que ellos pueden transferirse únicamente con la asistencia de los plásmidos conjugativos y lo hacen “por accidente”. Una clase intermedia de plásmidos son los “mobilizables” los cuales llevan solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden “parasitar” un plásmido conjugativo, transfiriéndose a una alta frecuencia solo en su presencia. Es posible para plásmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple. Siete tipos diferentes de plásmidos han sido encontrados en la E. Coli. Pero normalmente plásmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo una de ellos sobrevive en la línea celular, debido a la regulación de las funciones vitales de los plásmidos. Por lo tanto, los plásmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.

9 Según el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los plásmidos crípticos, de los que se desconoce su función fenotípica): Plásmidos R, que codifican una o más resistencias a drogas (antibióticos) y/o resistencia a metales pesados. Plásmidos bacteriocinogénicos, que codifican alguna bacteriocina y simultáneamente confieren inmunidad frente a esa bacteriocina a la bacteria que lo posee. Dentro de ellos, de los más estudiados son los plásmidos Col, que producen colicinas (bacteriocinas de E. coli). Plásmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas con la virulencia en muchas bacterias patógenas. Por ejemplo: plásmido de la toxina tetánica en Clostridium tetani. plásmido de la toxina del ántrax en Bacillus anthracis. Plásmidos que codifican factores de colonización (para la invasión de los tejidos de su hospedador). Plásmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas metabólicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y energía sustancias que otros organismos no pueden catabolizar: plásmidos OCT (degradación del octano); plásmidos TOL/XYL (degradación del tolueno y xileno); plásmidos NAF (degradación del naftaleno), etc. Plásmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones relacionadas con el establecimiento de las simbiosis fijadoras de nitrógeno en los nódulos radicales de las leguminosas (pSym y otros tipos). Plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la producción de tumores en numerosas plantas dicotiledóneas. Existen igualmente plásmidos que codifican más de un tipo de fenotipos: p. ej., plásmidos que suministran resistencia a antibióticos y capacidad de virulencia.

10 Plásmidos según el grupo de incompatibilidad
Plásmidos según el grupo de incompatibilidad. Recordar la definición de incompatibilidad entre plásmidos que se dio oportunamente, y la base de este fenómeno: dos plásmidos son incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma célula) porque comparten un mismo sistema de replicación y segregación de las copias. Como se sabe, los plásmidos se pueden clasificar según su pertenencia a un mismo grupo de incompatibilidad. Así p. ej., el plásmido F pertenece al llamado grupo IncFI; Los plásmidos R1 y R100, de resistencia a antibióticos, pertenecen al grupo IncFII. Obsérvese que dos plásmidos conjugativos pertenecientes a grupos de incompatibilidad diferentes pueden poseer regiones tra semejantes, y tipos de pelos sexuales parecidos. Esto es precisamente lo que ocurre con el F comparado con el R1 o el R100.

11 Prión Los priones o proteínas priónicas son partículas acelulares, patógenas y transmisibles. Se caracterizan por producir enfermedades que afectan el sistema nervioso central (SNC), denominadas encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). Los priones no son seres vivos. El aislamiento de priones a través del seguimiento del nivel de infectividad en las EET demuestra que las partículas infectivas están constituidas total o parcialmente por una forma modificada de la proteína prion. La proteína se expresa en varios tejidos, principalmente en neuronas del SNC, y se une a las membrana celular externa mediante una molécula de glicosil fosfatidil inositol (GPI). No se conoce en la actualidad cómo ocurre este cambio de estructura in vivo y cómo es que este cambio conduce a la EET. Los resultados experimentales sugieren que la acción patógena de los priones está muy relacionada con la forma modificada de una proteína natural existente en el organismo que, al entrar en contacto con las proteínas originales, las induce a adoptar la forma anómala del prión, mediante un mecanismo todavía desconocido. Todo ello en una acción en cadena que acaba por destruir la operatividad de todas las proteínas sensibles.

12 Teorías más recientes apuntan a que los priones son proteínas modificadas bajo ciertas circunstancias que favorecieron su caída a un nivel energético muy estable al oligomerizarse, lo que las hace insolubles, inmunes a las proteasas y les cambia su conformación tridimensional. Esta “estabilidad” provoca que dichas proteínas se acumulen en el sistema nervioso, pero se desconoce todavía cómo esta aparición de una nueva estructura provoca enfermedades por acumulación. De hecho, la “infección” con proteínas priónicas se debe a que, al consumirse, empiezan a actuar en el tejido nervioso como núcleos en torno a los cuales más proteínas se desnaturalizan bajo su acción y se acumulan, formando generalmente fibrillas insolubles.

13 Propiedades Físicas y Químicas
Propiedades Biológicas Filtrable con poros 25 nm o 100 nm.  Es invisibles al microscopio óptico y electrónico.  Resistente a: Formaldehido EDTA Proteasas ( Tripsina, pepsina ), aunque reducen la infectividad Nucleasas ( ribonucleasas A y III, desoxiribonucleasa I ) Radiación ultravioleta ( 2540 Å ) Radiación ionizante Largo periodo de incubación ( meses, años, décadas).  No producen respuesta inflamatoria  No antigénicos.  Patología crónica progresiva.  Fatal en todos los casos.  Carecen de cuerpos de inclusión.  Presencia de ácido nucleico no demostrada.  El único componente conocido es la proteína PrP.  Pueden existir en múltiples formas moleculares  Periodo de adaptación a nuevos hospedadores.  Control genético de la susceptibilidad de algunas especies.  Existencia de distintas cepas. Métodos de inactivación Autoclave >134 °C,  18 minutos Hipoclorito sódico (20ºC, 1hora)  Hidroxido sódico 2N  Fenol 90% Eter  Acetona  Permanganato potásico M  Urea 6 M  2 – Cloroetanol  Cloroformo

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15 INTEGRONES Los integrones son una familia de elementos genéticos potencialmente móviles capaces de integrar y expresar genes de resistencia a los antibióticos ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN Los integrones han sido detectados principalmente en bacilos Gram negativos fermentadores, de las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae, y en algunos no fermentadores, como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii. Además, se ha descrito un integrón funcional en bacterias Gram positivas, en una cepa de Corynebacterium glutamicum. Hasta la fecha se han descrito varias familias de integrones, al menos tres de ellas están relacionadas con la expresión de genes de resistencia. Sus integrasas presentan entre 45% y 58% de homología, sugiriendo una divergencia evolutiva por un período superior a 50 años, lo que corresponde, aproximadamente, a la era antibiótica. Los integrones no pueden realizar autotransposición pero se asocian frecuentemente a secuencias de inserción o bien, a transposones y plásmidos conjugativos que les sirven como vehículos para su transmisión inter e intra especie. Se han encontrado integrones de las clases 1 y 2 en plásmidos y transposones, en tanto aquellos de clase 3 sólo han sido observados en plásmidos. Por último, los integrones de clase 4 o "superintegrones" se han identificado principalmente en el cromosoma de Vibrio cholerae.