Metodología investigadora de células y tejidos

Presentación del tema: "Metodología investigadora de células y tejidos"— Transcripción de la presentación:

1 Metodología investigadora de células y tejidos
Por E. Carrascal

2 Investigación bioquímica

3 De celulas y tejidos vivos De celulas y tejidos muertos
Morfología De celulas y tejidos vivos De celulas y tejidos muertos In vivo Transiluminacion Camaras transparentes Naturales Artificiales In vitro Cultivos “Pach clamp”

4 Morfología de células y tejidos muertos
Evitar procesos degenerativos postmortem

5 Niveles degradativos postmortem.
Desequilibrio iónico Acidificación del medio Rotura de membranas. Acción de microorganismos Oxidación de grasas. Nivel bioquímico Nivel ultraestructural Nivel microscópico.

6 Como evitar los procesos degenerativos.
Congelación a -120 ºC (ideal) Fijación

7 Fijación Hidratos de carbono. Proteínas. Lípidos.

8 Fijación de los hidratos de carbono
- Evitar su hidrólisis y disolución. Para ello - Emplear fijadores que retengan agua (p.e. Alcohol) Inconveniente Los tejidos se endurecen demasiado, y hacen mas difícil su manipulación

9 Fijación de las proteínas.
Evitar su hidrólisis y fragmentación. Se consigue mediante Deshidratación. Desnaturalización. Formación de sales. Cambios del estado coloidal. Modificación del punto isoelectrico.

10 Desnaturalización de las proteínas mediante aldehidos
(Proteína) R - H + H - COH R - CH2OH + H - R´ R - CH2 - R´ H2O

11 Se degrada a ácido fórmico Guardar en frasco oscuro y refrigerado
El formaldehido: Se degrada a ácido fórmico H - COH H - COOH Para evitarlo Guardar en frasco oscuro y refrigerado Producir reciente de paraformaldehido

12 El tetróxido de osmio - CH2 - CH2 - CH = CH - CH2 - CH2 -
O O Os - CH2 - CH2 - CH - CH - CH2 - CH2 - O O Os

13 Causas que dificultan una fijación
Consejos para una buena fijación Causas que dificultan una fijación Autolisis Hiper-hipo osmia Desecación Grosor excesivo Tamaño diminuto Sangre y moco Frasco boca ancha Vol veces Temperatura 5ºC Posición anatómica Retracción. Perfusión. Flotación. Duración (3-6 h/5mm) Doble etiquetado

14 Modo de observación Directa En cortes

15 Observación directa Líquidos Centrifugado Filtrado Impronta Ganglios
Bazo Aplastamiento Pulmón Superficies Microscopio Electrónico de Barrido (MES)

16 Observación de cortes Sin endurecer Endurecido Inclusión
Mano alzada. 0,5-3 mm. Microtomo de mano. 0,5-0,1 mm. Vibratomo. 0,1-100 µ Endurecido Congelación µ Microtomo Criostato Inclusión Parafina 5-0,5µ Celoidina Resinas

17 Cortes por congelación
Criostato

18 Cortes en parafina Molde para rellenar con parafina
Bloque y preparación ya teñida. Microtomo de parafina y baño de flotación

19 Para ver detalles de las técnicas Histológicas vuelve a la aplicación.

20 Una vez obtenidos las secciones o cortes, es necesario teñirlos, pues los tejidos son transparentes. Para ello se emplean sustancias colorantes. La primera coloración histológica la hizo Antoni V. Leeuwenhoek al teñir las fibras musculares con azafrán, en 1670.

21 Los colorantes Por simple difusión. Sudan rojo.
Por afinidad química elemental: Acidofilia - basofilia. Por reacciones químicas concretas: PAS Metacromasia iónica. Azul de toluidina. Precipitación de sustancias fruto de una actividad enzimática: Fosfatasa. Empíricos: Nitrato de plata.

22 Por simple difusión Sudan rojo.
El Sudan III o rojo, difunde muy bien en las grasas y mal en alcohol, por eso se emplea una solución alcohólica de sudan para teñir las grasas.

23 Por afinidad química elemental.
Hematoxilina -- Básica Tiñe nucleos y RER (DNA y RNA) Basofilia Eosina -- Acida Tiñe citoplasmas Eosinofilia

24 Por reacciones químicas concretas: PAS
PAS (Periodic Acid Schiff) El ácido peryódico (I04H) reacciona con los enlaces 1-2 glicol (-CHOH-OHHC-) transformándolos en aldehídos (-OH HOC-) donde se fija el reactivo se Schiff F(SO3H)2 El ácido peryódico no actúa cuando los grupos glicol están bloqueados por radicales ácidos.

25 Metacromasia Azul de toluidina.
Ciertos colorantes en suspensión (con las moléculas desordenadas), poseen un color, que cambia (metas = otro, cromos = color) cuando las moléculas se ordenan. P.e. El Azul de Toluidina en suspensión es azul, y cuando se enfrenta a estructuras ricas en lugares aniónicos (heparina, condroitinsulfatos, etc,) las moléculas de azul de toluidina se ordenan sobre estas estructuras y toman color rojo.

26 Empíricos Nitrato de plata

27 Microscopio óptico Microscopio electrónico de transmisión

28 Óptico Electrónico de barrido Electrónico de transmisión

29 Electrónico de transmisión Electrónico de barrido

30 Inmuno histoquímica Técnica mediante la cual se detecta la presencia de un péptido o protéina en una célula o tejido, utilizando un anticuerpo (monoclonal ó policlonal, IgG ó IgM) específico contra él. La técnica esta basada en la reacción antígeno–anticuerpo y por ello el anticuerpo primario que se utilice debe haber sido generado en una especie diferente a la que se está estudiando. Existen dos tipos de métodos inmunohistoquímicos: I-Método Inmunohistoquímico Directo, en él, el anticuerpo específico contra la sustancia que se quiere detectar está marcado con partículas detectables al microscopio (ej.fluorescenciao peroxidasa)

31 Inmuno histoquímica II-Método Inmunohistoquímico Indirecto, en él, la señal del anticuerpo se amplía realizando sucesivas capas de anticuerpos o marcadores (como son Peroxidasa/Anti-Peroxidasa (PAP), Complejo de Avidina Biotina peroxidasa (ABC).

32 LISTADO DE TECNICAS DE INMUNOHISTOQUIMICA
ANTIGENO ANTIMELANOMA (HMB 45) ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO (PSA) AMILOIDE AA ANTIGENO SUPERFICIE (HEPATITIS B) ALFA 1 ANTITRIPSINA ALFA 1 ANTIQUIMOTRIPSINA ALFA FETOPROTEINA ALK proteína B BEREP4 BCL2 BCL6 C CA153 CALRETININA CATEPSINA D CALCITONINA CEA CELULAS FOLICULARES DENDRITICAS CELULAS PLASMATICAS (VS38) CERBB2 C4d (congelación y parafina) CD 20 (PAN B) CD 3 (PAN T ) CD 45 RB (PAN LEU ) CD1a CD 31 CD 34 CD15 CD19 CD23 CD30 (Ki1) CD 4 CD43 CD45RO CD 68 (MACROFAGOS) CD79a CD8 CD10 CD74 H HPV1 (HERPES I) HPV2 (HERPES II) HORMONA SECRETORA HEPATOCITOS MARCADOR I IG A IG G IG M IG D INSULINA INHIBINA ALFA K KAPPA Ki 67 L LAMBDA (CADENAS LIGERAS) LH LECTINAS: LEU 7 (CD57) LISOZIMA M MELANINA MIOGLOBINA MIELOPEROXIDASA MIOSINA MYOD1 MIC2 (CD99) N NEUROFILAMENTOS (NF) NSE (ENOLASA NEURONAL ESPECIFICA) O OSTEOPONTINA P PAPILOMAVIRUS PROLACTINA PCNA P53 PTH (PARATHORMONA) PROTEINA ALK PROTEINA PRIONICA P27 CD79a CD 5 CD 44std CD 44 V6 CD138 (CELULAS PLASMATICAS) CAM 5.2 (CITOQUERATINA BAJO PESO MOLECULAR) 34 BETA E12 (CITOQUERATINA ALTO PESO MOLECULAR) CITOQUERATINAS 5/6 CITOQUERATINA 7 CITOQUERATINA 13 CITOQUERATINA 19 CITOQUERATINA 20 CITOMEGALOVIRUS CICLINA D1 COLAGENO IV COLAGENO XI CORE (HEPATITIS B) CROMOGRANINA A C-KIT (CD117) D DESMINA E E-CADHERINA EMA (ANTIGENO EPITELIAL DE MEMBRANA) F FACTOR VIII FACTOR DE CRECIMIENTO PLAQUETARIO (PDGFR-ALFA) FIBRONECTINA FOSFATASA ACIDA PROSTATICA FOSFATASA ALCALINA PLACENTARIA FSH G GASTRINA GFAP (PROTEINA GLIAL FIBRILAR ACIDA) GLUCAGON GONADOTROPINA CORIONICA (HCG) GRANZIMA B

33 TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA:
RECEPTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO (EGFR) RECEPTOR DE ESTROGENOS RECEPTOR DE PROGESTERONA S SEROTONINA SINAPTOFISINA SOMATOSTATINA S 100 PROTEINA T TIMIDILATO SINTETASA (TS) TIROGLOBULINA TSH TRIPTASA (MASTCELL) TROMBOMODULINA TTF1 U UBIQUITINA V VIMENTINA VIRUS EPSTEINBARR (LMP1) VIRUS PAPILOMA PARA SCREENING EN CITOLOGIAS TECNICAS HISTOENZIMATICAS PARA MUSCULO: HE FOSFATASA ACIDA TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA: HE IgG IgA IgM C3 C4 C1q FIBRINOGENO ALBUMINA H HGH TECNICAS PARA HUESOS: VON KOSSA TECNICAS PARA CEREBROS: NISSL K. BARRERA BIELCHOWSKY TECNICAS EN CONGELACION: SUDAN ROJO OIL RED O TIROSINASA GANGLIO CENTINELA MELANOMA (MATERIAL EN FRESCO Y SANGRE PERIFÉRICA DIRMA

34 TECNICAS DE PATOLOGIA MOLECULAR.
PCR EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA (5 CORTES DE 10 MICRAS EN TUBOS EPPENDORF), CITOLOGÍAS Y LÍQUIDOS: CITOMEGALOVIRUS HERPES SIMPLE TIPO 1 HERPES SIMPLE TIPO 2 HERPES TIPO 6 MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (Hibridación) VIRUS EPSTEINBARR (Hibridación) EGFR KRAS NRAS BRFA MEA2 HIBRIDACIÓN "IN SITU" CON FLUORESCENCIA (FISH). ALK. OTRAS UTILIZADAS AE1/ AE3 CALDESMON CALPONINA FAS R HHV8

35 Automatización de procedimientos.
Inclusión en parafina Tinción

36 Automatización de procedimientos.
Montador de cubres Inmuno histoquímica

37 Genómica

38 El proyecto genoma humano.

39 Genómica

40 Genómica La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo fragmento original o molde.

41 Genómica Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.

42 Test genómico de mama. Análisis simultáneo de 60 genes.
Mínima cantidad de tejido. Manejo sencillo.

43 Genómica en el cáncer de Mama.

44 Test genómico de mama. PCR (Reacción Catalítica de la Polimerasa

45 Marcadores en el cáncer de mama

46 Terapia derivada de los tipos de Ca de mama encontrados

47 Fin