Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A

Presentación del tema: "Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A"— Transcripción de la presentación:

1 Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A
Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de la concentración de proteínas

2 Objetivos Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una proteína. Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína. Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. Determinar la concentración mediante la detección de la absorbancia a 280nm. Determinar la concentración de una proteína utilizando un método colorimétrico: Determinación de proteínas por Bradford. Analizar el progreso de la purificación de una proteína. Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína: rendimiento y pureza. Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas.

3 Cómo monitorear un proceso de purificación?
Para evaluar de manera cuantitativa el éxito de una purificación de proteínas es necesario conocer dos parámetros: el rendimiento y el grado de pureza de cada paso del proceso de purificación.

4 Ir construyendo su tabla de purificación...

5 El rendimiento Parámetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad biológica de la proteína de interés en cada paso de la purificación. El 100% corresponde a la actividad del extracto inicial.

6 Grado de pureza Se refiere al incremento en pureza, valor que se obtiene de dividir la actividad específica de cada paso entre la actividad específica del paso inicial de purificación, este índice da el valor de 1 para el extracto inicial. La actividad específica se expresa en Unidades/ mg proteína-1

7 Tabla de purificación

8 ¿Qué necesitamos hacer para construir nuestra tabla de purificación de la LDH?
a) una técnica que determine la concentración de proteínas en la muestra, y b) una técnica que específicamente detecte o mida la cantidad de la proteína blanco (Unidades de actividad).

9 . Nishimune T et al. J. Nutr. 2000;130:1625-1628
©2000 by American Society for Nutrition

10 Chromatofocusing of RGP-2 on mono-P.
Chromatofocusing of RGP-2 on mono-P. The concentrated fraction C of RGP-2 from the arginine-Sepharose column, with buffer changed to 20 mm Bis-Tris, pH 6.3, by ultrafiltration, was loaded on a mono-P column equilibrated with the same buffer. The pH gradient was developed with 50 ml of Polybuffer 74 with pH adjusted to 4. Activity peaks eluted at the same pH after chromatofocusing of RGP-2 fractions A, B, and C were considered to be the same isoform of the enzyme, pooled together, concentrated by ultrafiltration with buffer exchange to 20 mm Bis-Tris, 1 mm CaCl2, 0.02% NaN3, pH 6.5, and analyzed by SDS-PAGE (inset, a), isoelectrophoresis (inset, b), and zymography (inset, c). Lane 1, RGP-2 mixture of isoforms after DE-52 except inset B, where pI standards were separated on line 1; lane 2, RGP-2 isoform I; lane 3, isoform II; lane 4, isoform III; and lane 5, isoform IV. Potempa J et al. J. Biol. Chem. 1998;273: ©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

11 Determinación de proteínas mediante un método no destructivo
A 280 nm

12 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO ABS 280 NM.
 Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV. Leer la absorbancia las fracciones que te indique el profesor a la longitud de 280 nm.

13 Calcular la concentración de proteína y llenar la tabla

14 Después.. ¿porqué usar Bradford?
Usar el estimado para determinar las diluciones o alícuotas a usar en la determinación colorimétrica de proteínas. Recordar que la sensibilidad del Bradford es de 1 a 20 µg de proteína con una absorbancia máxima aproximada de 0.6. ¿porqué usar Bradford?

15 Determinación de proteínas por Bradford
Construcción de curva patrón Determinación de proteínas de las muestras

16 Se utilizará una curva estándar de BSA
Añadir los reactivos en el orden mostrado, agitando después de cada adición. ¡Precaución, maneja con cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H3PO4!. Registrar la absorbancia a 595 nm. Graficar absorbancia del estándar vs cantidad de proteína (g) y obtener los parámetros de regresión. 1000 uL

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18 Calcular la concentración de proteína
Utilizar los parámetros de regresión obtenidos de la curva estándar, para calcular el contenido de proteína de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente fórmula: Donde, b es la ordenada al origen, m la pendiente y F es el factor de dilución de cada muestra. El valor obtenido en 9 dividirlo entre el volumen de muestra que utilizaste en el ensayo, obteniendo la concentración de proteína en µg/µL. Posteriormente realizar los promedios por muestra, recuerda que tienes duplicados para cada fracción.

19 Rendimiento proteico