Paredes celulares procariotas (3)

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1 Paredes celulares procariotas (3)
Biosíntesis del PG. Protoplastos y esferoplastos. Formas L En este tema vamos a abordar la biosíntesis y crecimiento del PG, así como las formas carentes de pared celular.

2 Cómo sintetizar un sáculo cerrado fuera del protoplasto
El PG es una estructura “cerrada” Pero debe de “crecer”  Debe de “abrirse” de algún modo controlado para incorporar nuevo material Debe facilitar el proceso de división en dos células hijas, a partir de un septo ¿Cómo transportar una macromolécula tan grande al exterior? ¿Cómo se resuelve el aporte de energía para la biosíntesis en el exterior del protoplasto? Desde el punto de vista topológico, todas las capas de las envueltas bacterianas (membranas, pared celular) son superficies cerradas sobre sí mismas, físicamente continuas para mantener la integridad y viabilidad de la célula. Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de expandirse durante el crecimiento por incorporación de nuevos materiales. Además, todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e incorporarse en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de las bacterias Gram-negativas, distintos componentes deben de ir a parar a diferentes localizaciones: periplasma, PG, membrana externa, e incluso medio exterior. Durante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales de las envueltas (y concretamente, de la pared celular que nos ocupa ahora) deben de facilitar la división de la célula en una descendencia de dos células hijas. Finalmente, queda el problema de la energía. Los procesos biosintéticos requieren aporte de energía química, pero el ATP y compuestos similares no pueden salir del protoplasto. Precisamente en este capítulo vamos a ver algunas de las estrategias bioquímicas y moleculares que las bacterias han evolucionado para solventar estos puntos para el caso del peptidoglucano. Veremos que la estrategia implica varias fases.

3 Biosíntesis del PG: visión de conjunto
Síntesis de precursores solubles en el citoplasma Los precursores son recogidos por un transportador de membrana y se forman las uu. disacarídicas con el pentapéptido Las uu. disacarídicas-(pentapéptido), expuestas al exterior, son polimerizadas  cadenas lineales de PG La cadena lineal de PG recién formado se une al PG preexistente por transpeptidación Síntesis de precursores solubles en el citoplasma. Estos precursores son transferidos a un transportador lipídico situado en la membrana citoplásmica (un poliisoprenol fosfatado llamado undecaprenil-fosfato), donde se forman las unidades disacarídicas con el pentapéptido. Las unidades disacarídicas se polimerizan en cadenas lineales fuera de la membrana, pero aún unidas al undecaprenil-fosfato de la membrana. Unión del polímero lineal así formado al peptidoglucano preexistente en la pared celular, por entrecruzamiento de (al menos) parte de sus péptidos respectivos. A estas etapas hay que añadir una fase adicional de regeneración del transportador lipídico, una vez que ha cumplido su misión, para que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de síntesis.

4 Fase 1 (en el citoplasma)
Activación de los monosacáridos: UDP-NAG UDP-NAG + PEP  UDP-NAM Unión secuencial aa. al NAM (con ATP y Mn): NAM-L-ala NAM-L-ala-D-glu NAM-L-ala-D-glu –di aa (m-DAP, L-Lys) NAM-L-ala-D-glu –di aa-D-ala-D-ala Al final de esta fase tenemos en citoplasma: UDP-NAM-(pentapéptido) Fase 1:. Los monosacáridos que luego van a constituir la unidad disacarídica repetitiva del esqueleto del peptidoglucano (NAM y NAG) se activan al unirse a uridín difosfato (UDP). (En general, los monosacáridos que han de incorporarse a polímeros de pared celular bacteriana se activan mediante su unión con nucleósidos-fosfato.) Por lo tanto, en esta fase se sintetizan por separado: NAG-UDP y NAM-UDP Luego se va produciendo la adición secuencial y ordenada de los distintos aminoácidos al NAM (en reacciones que requieren energía e iones Mn++): 1. L-ala 2. D-glu 3. m-DAP (u otro diaminoácido; p. ej. L-lys en Staphylococcus aureus) 4. D-ala-D-ala Observar que no se produce un tetrapéptido, sino un pentapétido. El último paso de adición de aminoácidos es la unión del dipéptido D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases: · una racemasa convierte la L-ala a D-ala; · creación de enlace peptídico entre dos D-ala.

5 Esquema de la biosíntesis del pepetidoglucano

6 Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido (a)
El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el UDP hasta el bactoprenol-P  bactoprenol-P-P-NAM-(pentapéptido) Fase 2: El UDP-NAM-pentapéptido se transfiere ahora a un transportador de membrana, llamado undecaprenil-fosfato (que abreviaremos como Lip-P). El undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 átomos de C (C55, derivado de la repetición 11 veces de la unidad isoprenoide, con un fosfato terminal). Antiguamente se le conocía con el nombre de bactoprenol, pero esta denominación ha caído en desuso desde que se sabe que no es exclusivo de bacterias. El bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de sustancias que, como los azúcares, son hidrofílicas, y no podrían pasar por sí mismas la barrera hidrofóbica de la membrana. Una vez que el NAM-pentapétido está unido al undecaprenil (por medio de pirofosfato) se produce la unión con la NAG, en una reacción de transglucosidación que genera el enlace ß(14) entre NAG-NAM. Por lo tanto, se obtiene: Lip-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG. En esta situación es cuando se producen la modificaciones que ya estudiamos en la estructura básica del PG. Por ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-glutámico en posición (2) es amidado (pasa a --CO-NH2. Por otro lado, se introducen los puentes peptídicos, que en el caso de esta bacteria consisten en una pentaglicina, que se une al grupo amino terminal de la L-Lys en posición (3).

7 Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido (b)
El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el UDP hasta el bactoprenol-P  bactoprenol-P-P-NAM-(pentapéptido) Ahora se transfiere la NAG desde el UDP para unirse por transglucosidación con el NAM. Tenemos, pues: bactoprenol-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG Bactoprenol está en membrana citoplásmica. NAM(pentapéptido)-NAG está en principio colgando hacia el citoplasma, pero ahora...

8 Esquema de la biosíntesis del pepetidoglucano

9 Fase 3: transglucosidación y producción de PG lineal
... El bactoprenol cargado con la unidad NAM(pentapéptido)-NAG se va al otro lado de la membrana (flip-flop), con lo que la unidad queda expuesta hacia el exterior Transglucosidación: dos unidades de bactoprenol-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG reaccionan Queda libre un bactoprenol-P-P ( bactoprenol-P, por fosfatasa específica) Queda un bactoprenol-P-P unido a dos unidades de NAM(pentapéptido)-NAG La reiteración de transglucosidación va generando cadenas largas de PG naciente unido por un extremo a bactoprenol Fase 3: Polimerización de varias unidades disacarídicas: ello se logra en una reacción de transglucosidación. Consiste en la unión de cada unidad disacarídica (con su pentapéptido) unida a su respectivo Lip-P-P, con el extremo libre (reductor) de una cadena preexistente que a su vez está unida a otra molécula de Lip-P-P. En el proceso se libera uno de los Lip-P-P (o sea, el undecaprenil, pero en forma pirofosforilada). Sobre este Lip-P-P actúa una fosfatasa específica, que elimina el fosfato terminal, regenerándose el undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el descrito.

10 Esquema de la biosíntesis del PG

11 Fase 4: transpeptidación: creación de PG entrecruzado
El PG naciente (con sus pentapétidos) unido al bactoprenol reacciona por transpeptidación con un PG aceptor preexistente: El –CO de la D-ala(4) reacciona con el NH2 libre del di-aa(3) Entrecruzamiento entre dos cadenas de PG Se libera la D-ala(5) Fase 4: El polímero surgido de la fase anterior es una cadena lineal de PG sin entrecruzar, y unido aún al transportador lipídico de membrana. Ahora este polímero naciente (con sus pentapéptidos) reacciona, por transpeptidación, con un PG aceptor preexistente. En esta reacción se ven implicados el grupo C=O de la D-ala (4) del PG naciente y el grupo -NH2 libre del diaminoácido (3) del PG aceptor (o del último aminoácido del puente peptídico). Esto es lo mismo que decir que el enlace peptídico entre D-ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve sustituido por otro enlace peptídico, entre dicha D-ala (4) y el diaminoácido del PG naciente. La energía para esta reacción la suministra la hidrólisis concomitante del enlace peptídico entre las dos D-ala terminales. Es decir, en cada reacción de transpeptidación se libera una D-ala, correspondiente a la que ocupaba la posición (5). Ya dijimos en el capítulo anterior que no todos los tetrapéptidos participan en entrecruzamientos. Las D-ala terminales (en 5) de los péptidos no implicados en tales entrecruzamientos son eliminadas por una enzima llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta enzima explica no sólo que en el PG maduro existan tetrapéptidos (y no los pentapéptidos originales), sino también la existencia de tripéptidos.

12 Detalle de la reacción de transpeptidación
Obsérvese que la reacción de transpeptidación supone la “sustitución” del enlace peptídico entre la D-Ala(4) y D-Ala(5) por otro enlace peptídico entre la D-Ala(4) y el diaminoácido en (3) del pentapéptido de otra cadena de PG. De esta forma, se evita el problema del suministro de ATP (imposible fuera del protoplasto). Esta es la reacción inhibida por la penicilina y otros antibióticos beta-lactámicos.

13 Esquema de la transpeptidación en una bacteria Gram-negativa y en otra Gram-positiva

14 Antibióticos que actúan sobre la biosíntesis del PG
Fosfomicina: inhibe la formación de NAM a partir de NAG Cicloserina: inhibe la racemización de la Ala, así como la formación del dipéptido D-ala-D-ala Tunicamicina: inhibe la traslocasa (2ª fase) Vancomicina: inhibe transglucosidación (3ª fase) Bacitracina: impide la regeneración del bactoprenol ß-lactámicos: inhiben transpeptidación (fase 4ª: entrecruzamiento de cadenas de PG Tienen un efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos del ciclo de síntesis y ensamblaje del PG, provocan la acumulación de precursores de dicho PG, lo que a su vez desencadena la activación de las autolisinas de la bacteria, que degradan el PG y que finalmente provoca la lisis celular (en medios hipotónicos), por entrada masiva de agua a la célula. 1. Fosfomicina: actúa inhibiendo la formación del 3-O-D-lactil-éter de la NAG (o sea, del NAM). 2. Cicloserina: Se comporta como análogo estructural de la D-alanina, por lo que inhibe la actuación de la racemasa que convierte la L-ala a D-ala, así como de la reacción de unión de dos D-ala. 3. Tunicamicina: inhibe la traslocasa que cede el NAM unido hasta entonces al UDP y lo pasa al bactoprenol (fase 2ª). 4. Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda transglucosidación (fase 3ª), es decir, la unión de diversas unidades disacarídicas. 5. Bacitracina: se une al undecaprenol-P-P, bloqueando su desfosforilación, e impidiendo por lo tanto, la regeneración del transportador de membrana. 6.      Antibióticos ß-lactámicos (p. ej.: penicilinas, cefalosporinas): inhiben la reacción de entrecruzamiento por transpeptidación.  

15 Crecimiento de pared celular: papel de las autolisinas
Para que el PG crezca coordinadamente y se pueda formar el septo transversal, hay una serie de enzimas: “autolisinas” Muchas autolisinas son sitios de acción de penicilinas BPBs PBP1: síntesis de PG durante elongación PBP2: crecimiento forma bacilar PBP3: síntesis de PG en el tabique transv. PBP4: hidrólisis entrecruzamientos en elongación PBP5: destrucción pentapéptido no entrecruzado Como ya dijimos al comienzo de este tema, aunque la pared celular es una estructura cerrada y sin solución de continuidad, debe permitir su expansión (crecimiento), y esto supone que se han de romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se ensamble con el preexistente mediante nuevas uniones, es decir, debe existir una acción concertada de mureín-hidrolasas y de mureín-sintasas. Por otro lado, hay que tener en cuenta que en el crecimiento de la pared celular se producen dos tipos de procesos: la expansión (aumento de tamaño) de esa pared, y la formación del tabique transversal en el centro de la célula. El crecimiento y septación del peptidoglucano están basados en la actividad controlada y localizada en puntos determinados, de una gama de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad transglucosidasa y/o transpeptidasa. Debido a que estas enzimas son los sitios de acción de las penicilinas (y otros antibióticos ß-lactámicos), se les conoce también con el nombre de PBP (de penicillin-binding proteins).

16 Crecimiento pared en Gram-negativa (E. coli)
Crecimiento en longitud (elongación)  la célula crece en tamaño Producción del tabique transversal (septación)  formación de 2 células hijas El crecimiento de la pared en E. coli se puede considerar dividido en dos fases: 1.  Crecimiento en longitud (elongación), mientras la célula crece en tamaño. 2. Producción del tabique transversal (septación), que conduce a la formación de dos células hijas.

17 Elongación de la pared en Escherichia coli
Las PBPs1 se encargan de la elongación del PG naciente: Transglucosidación de uu. disacarídicas Transpeptidación entre tetrapéptidos de cadenas adyacentes Las cadenas nacientes de PG se intercalan en el PG preexistente: PBP4 y PBP5 cortan enlaces del PG previo PBP2 interviene en la transpeptidación La elongación se hace en la parte cilíndrica de la célula, en forma dispersa (˜200 puntos) Elongación · Las PBPs 1 son las encargadas de la elongación de las cadenas de PG naciente (por transglucosidación de las unidades disacarídicas) y simultáneamente, por transpeptidación, logran el entrecruzamiento. · Las cadenas nacientes del PG se intercalan en la parte cilíndrica del sáculo de PG gracias a que las PBP4 y PBP5 cortan enlaces del PG preexistente. La PBP2 interviene aquí también para transpeptidación. La cadena de PG se va elongando unidireccionalmente alrededor de la circunferencia de la célula. Se calcula que existen unos 200 sitios de inserción de nuevo material en cada célula, dispersos de forma más o menos uniforme por toda la superficie de la célula. La maquinaria biosintética tarda 8 minutos en completar cada circunferencia de elongación.

18 Septación de la pared en Escherichia coli
Ensamblaje del “divisoma” por debajo de la membrana, en el centro del bacilo (modelo aún hipotético): FtsZ (parecida a tubulina) se ensambla, formando un “anillo citocinético” que “tira” de las envueltas hacia el interior Luego se activa la PBP3(=FtsI), una transglucosidasa/transpeptidasa del septo Otras proteínas Fts La división de la bacteria por fisión binaria simétrica se logra por medio de una invaginación circular de las envueltas (membrana citoplásmica y peptidoglucano) en mitad de la célula madre. En el inicio de este proceso tiene un papel esencial la proteína FtsZ, y más tarde intervienen otras proteínas Fts. FtsZ es una proteína imprescindible, presente tanto en eubacterias como en arqueas, que muestra parecido con las tubulinas eucarióticas. Al parecer, al igual que las tubulinas, la FtsZ se une a GTP, con lo que se promueve su polimerización. Bajo control del ciclo celular, la FtsZ se ensambla poco antes de la división en el centro de la célula, formando un “anillo citocinético” en el lado citoplásmico de la membrana celular. Existen indicios fuertes de que la formación de este anillo de FtsZ señaliza el sitio por donde se producirá la división y se activará el crecimiento del peptidoglucano del tabique transversal. Una vez que FtsZ ocupa el lugar del futuro septo, entran en acción otras proteínas Fts, formando un complejo llamado “divisoma”. La hipótesis señala que los polímeros de FtsZ se van “contrayendo”, de modo que “tiran” de las envueltas hacia el interior, provocando la típica invaginación alrededor del centro del bacilo, y que simultáneamente, la FtsZ provoca la activación de la PBP3 (=FtsI), que es una transglucosidasa/transpeptidasa específica del tabique transversal.

19 Crecimiento y septación de PC en Enterococcus faecalis
El crecimiento de la PC es zonal: comienza en centro y avanza hacia fuera Célula adulta con banda ecuatorial donde la PC se hace más gruesa Debajo de este engrosamiento, se va depositando nuevo material de PC. Aparece una muesca en banda ecuatorial El tabique (doble grosor de PC normal) avanza... ... hasta que se completa El tabique de doble grosor se escinde simétricamente por autolisinas A diferencia de lo visto en E. coli, en el enterococo (Enterococcus faecalis) el crecimiento del PG no es difuso, sino zonal, comenzando en el centro (zona ecuatorial) y avanzando hacia afuera. El proceso se puede describir así: 1.   En la célula adulta antes de la división aparece una banda ecuatorial donde la pared celular se hace más gruesa. 2. Debajo de esta zona engrosada (hacia el interior del citoplasma) se va depositando nuevo material, lo que marca el inicio de la formación del tabique transversal. Enseguida aparece una muesca en la banda ecuatorial. 3. El tabique, con un grosor doble al de la pared celular de la superficie celular, sigue avanzando, hasta que... 4. ... se completa. Simultáneamente a los pasos 3º y 4º la zona de nueva síntesis de P.C. superficial alcanza el ecuador de las celúlas hijas nacientes. 5.  El tabique completo de doble grosor va siendo escindido en dos mitades desde el exterior hacia el centro, por acción de autolisinas. De esta forma se le adjudica a cada célula hija la nueva pared correspondiente a uno de sus polos (el otro procede, intacto, de la célula madre).

20 Crecimiento zonal de la PC del Enterococcus faecalis
Esquema que ilustra lo explicado en la diapositiva anterior: obsérvese las bandas ecuatoriales engrosadas de PC, que se van “separando” hacia fuera, mientras que se va sintetizando material nuevo en el interior. En el centro se formará un tabique transversal, cuya fisión señalará el nacimiento de las dos células hijas.

21 Protoplastos y esferoplastos
En laboratorio se pueden lograr células desprovistas total o parcialmente de PC Protoplastos: células procarióticas carentes totalmente de pared celular Esferoplastos: células procarióticas carentes parcialmente de pared celular Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. Se denominan protoplastos las células bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas células bacterianas que poseen restos de pared.

22 Métodos de obtención de protoplastos y esferoplastos
Por destrucción del PG con lisozima o peptidasas En Gram-negativas hay que desorganizar antes la membrana externa con el agente quelante EDTA (secuestra cationes) Por inhibición de la formación de nuevo PG en células en crecimiento Ej.: tratando las células con penicilina Obtención. Existen dos posibles métodos alternativos: 1. Por destrucción del entramado del PG mediante enzimas líticas (lisozima, peptidasas). En el caso de bacterias Gram-negativas, previamente hay que desorganizar la membrana externa para hacerla permeable a estas enzimas. Ello se logra usando el quelante EDTA y/o sometiendo las células a bajas temperaturas. 2. Por inhibición de la formación de nuevo PG en las células en crecimiento, tratándolas p. ej., con penicilina. Si se parte de un mutante auxotrofo para un componente del PG basta hacer crecer a la bacteria en un medio carente de dicho componente.  Estos métodos permiten: · en el caso de Gram-positivas, la desorganización total de su pared, por lo que se obtienen protoplastos; · en el caso de las Gram-negativas, quedan restos de membrana externa y de peptidoglucano atrapados en ella, por lo que se obtienen esferoplastos.

23 Protoplastos y esferoplastos son osmóticamente sensibles
Protoplastos y esferoplastos son formas osmóticamente sensibles debido precisamente a que al no existir o estar desorganizado parcialmente el PG, ya no se pueden contrarrestar las fuerzas de presión osmótica existentes en los medios hipotónicos en que normalmente se cultivan o suspenden las bacterias.

24 Suspensiones estables de protoplastos y esferoplastos
Hay que obtenerlos en un medio isotónico o ligeramente hipertónico: NaCl M Sorbitol o sacarosa M Polietilenglicol (PEG) al 7.5% En estos medios protoplastos y esferoplastos tienen formas esféricas, cualquiera que fuera la forma original de la bacteria En medios adecuados, protoplastos y esferoplastos pueden regenerar la PC Por lo tanto, si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas, hay que obtenerlas en medios o soluciones isotónicos o ligeramente hipertónicos, para evitar su lisis: ·  soluciones de NaCl 0,25-0,5 M; ·  sorbitol o sacarosa 0,1-0,5 M; · polietilénglicol (PEG) al 7,5%. En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas esféricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria con pared de que proceden.

25 Los protoplastos… (a) en medios hipotónicos el agua entra y termina lisando la célula; (b) en una solución isotónica, el agua no entra al protoplasto, y este permanece estable. ¿Recuerdas dónde actúa la lisozima para desorganizar el peptidoglucano?

26 ¿Para qué sirven los protoplastos y esferoplastos?
Método suave de obtener extractos libres de células y fracciones subcelulares Para hacerlas permeables a ADN, en experimentos de transformación artificial (ej.: en ingeniería genética) Fusión de protoplastos (para obtener recombinantes somáticos) Se emplean en varios aspectos de investigación básica y aplicada: · método suave para luego obtener extractos libres de células y fracciones subcelulares. · en algunas bacterias, método para hacerlas permeables al ADN, en experimentos de transformación genética (para hacer ingeniería genética, por ejemplo). · para realizar fusión entre protoplastos de diferentes cepas de la misma especie e incluso entre especies distintas. Se trata de un método de obtención de “recombinantes somáticos” usado para determinados estudios genéticos en bacterias que no tengan sistemas naturales de transferencia genética.

27 Formas L Formas L naturales:
Carentes totalmente (o casi) de PC que algunas bacterias generan espontáneamente en medios a base de suero (que son hipertónicos) Ejemplo: Streptobacillus moniliformis Colonias en forma de “huevo frito” Formas L inducidas: tratamiento con penicilina en medio hipertónico L inestables: tratamiento breve; revierten PC L estables: tratamiento prolongado; no revierten PC Son células bacterianas carentes total o casi totalmente de P.C., con formas pleomórficas, irregulares y globulares, que se producen de forma espontánea en algunas especies bacterianas (p. ej., Streptobacillus moniliformis) cuando se cultivan en medios a base de suero (que son hipertónicos). Las colonias de las formas L naturales son muy características: en “huevo frito”, bifásicas. Se pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, tratándolas con penicilina en medios hipertónicos. Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y pueden revertir con frecuencia a la forma normal con pared. Poseen algo de PG, aunque éste se encuentra alterado respecto al PG de la célula normal. Las formas L estables se producen por tratamientos más prolongados, y no suelen revertir al tipo normal. La mayoría carecen totalmente de peptidoglucano. Así pues, en las formas L el peptidoglucano ha sido eliminado total o parcialmente, pero de manera que ya no puede servir de aceptor de nuevo PG.